Pattern Recognition Receptors בקידום תהליכים אתרוסקלרוטים ע"י פתוגנים פריודונטלים

Transcript

1 מעורבות Pattern Recognition Receptors בקידום תהליכים אתרוסקלרוטים ע"י פתוגנים פריודונטלים חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה מאת שני אבניאל- פולק הוגש לסנט האוניברסיטה העיברית, בירושלים אוגוסט 211 1

2 מעורבות Pattern Recognition Receptors בקידום תהליכים אתרוסקלרוטים ע"י פתוגנים פריודונטלים חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה מאת שני אבניאל- פולק הוגש לסנט האוניברסיטה העיברית, בירושלים אוגוסט 211 2

3 עבודה זו נעשתה בהדרכתו של: ד"ר גבריאל נוסבאום 3

4 שלמי תודות ברצוני להודות למספר אנשים שליוו אותי במהלך לימודי הדוקטורט שלי לד"ר גבריאל נוסבאום אני רוצה להודות על היותו המנחה שלי ועל כך שלימד אותי חשיבה מדעית איכותית ועבודה בסטנדרטים גבוהים. אני מודה לו על כך שתמך בי לכל אורך הדרך ודלתו תמיד היתה פתוחה לעצה טובה, הכוונה ושיחה בכל נושא שהוא ועל כך שדחף אותי קדימה ולימד אותי לא להתפשר על פחות מהטוב ביותר. לד"ר אביב שיש וחנה לבקוביץ' מהמכון לחקר ליפידים בביה"ח שיבא אני רוצה להודות על העזרה עם הפקת ה- LDL, ועל עצותיהם המלמדות. אני מודה לחברי למעבדה שליוו אותי במהלך הדוקטורט על סביבת עבודה נעימה וחברית על התמיכה, ההקשבה והעזרה כשצריך. להורי שליוו אותי בכל התהליך ותמכו בי נפשית ככל שיכלו. לאחרונים וחביבים ביותר אני רוצה להודות לבעלי דודו פולק על תמיכתו האינסופית בי ולשני ילדי המקסימים ליה ואביב- על האהבה ושמחת החיים, אתם מביאים אור לחיי. 4

5 תקציר רקע: מחקרים רבים מצביעים על זיהומים פריודונטליים כגורמי סיכון לטרשת עורקים ומחלות של כלי הדם. ישנן עדויות לכך שחיידקים המעורבים במחלה פריודונטלית נודדים לתוך הנגע הטרשתי. היא חלק מרכזי ממערכת החיסון המולדת אשר קשורה )TLRs( משפחת ה- Receptors Toll Like בזיהוי פתוגנים ובהתחלה של תגובה אימונית. כיום מייחסים לקולטנים אלו מעורבות הולכת וגדלה בתהליכים המקדמים טרשת עורקים. בעבודה זו בחנו את הקשר האפשרי בין זיהום של מחלת חניכיים לבין תהליכיים הקשורים.TLRs בהתפתחות טרשת עורקים, והאפשרות לכך שקשר זה מתווך על ידי ה- משפחת נעשה gingivalis) Porphyromonas gingivalis (P. ו- שימוש בשני חיידקים מרכזיים במחלת חניכיים - בחנו nucleatum).fusobacterium nucleatum.f) תהליכים מוקדמים אשר קשורים לטרשת עורקים כגון צבירת ליפופרוטאינים במקרופאגים לאחר חשיפה לחיידקים הפתוגנים. שיערנו שכניסת או modified LDL המתווכת ע"י הפתוגנים תערב את LDL (Low density lipoprotein) הרצפטורים העיקריים האחראיים לזיהוי חיידקים של מערכת החיסון המולדת האדפטור שלהם. ו/או את חלבוני F. ו- nucleatum P. gingivalis מטרת המחקר: )1( חקר המנגנונים דרכם החיידקים האוראליים TLRs (2) משפיעים על צבירת LDL ו- LDL modified במקרופאגים. קביעת מעורבות וחלבוני (3) אדפטור תוך תאיים ספציפיים בתהליך צבירת ליפופרוטיאינים במקרופאגים. חקר שרשרת העברת הסיגנל של בליעת LDL ו- (AcLDL) modified LDL בעקבות חשיפה לחיידקים אלו. שיטות עבודה וממצאים עיקריים: בדיקת יצירת תאי קצף בשורת תאי מקרופאגים לאחר אינקובציה עם.P gingivalis או.F nucleatum נעשתה ע"י צביעה לליפידים והראתה שישנה הגברה בעקבות אינטראקציה עם הפתוגנים מעבר ליצירת תאי הקצף הספונטנית. מקרופאגים הופקו מעכברי WT או מעכברי knockout החסרים ברצפטור או מולקולת העברת סיגנל מסויימת. כניסת LDL או AcLDL המסומנים פלורוסנטית לתאים נמדדה ע"י FACS לאחר אינקובציה P. gingivalis בנוכחות F. nucleatum או או בלעדיהם. התמקדנו ב- TLRs העיקריים המעורבים 5

6 בזיהוי חיידקים: TLR2,TLR4, TLR9 ו- CD14 ובחנו את מעורבות חלבוני האדפטור שלהם.(MyD88 adapter like) ו- MAL בבחינה של (myeloid differentiation factor 88) MyD88 P. gingivalis תהליך כניסת LDL )כתהליך מוקדם המוביל ליצירה של תאי קצף( מצאנו שהחיידק TLR2 גורם להגברה בבליעת ה- LDL באופן התלוי ברצפטורים ו- CD14 ודרך חלבוני האדפטור P. gingivalis ו- MyD88. הגברה בכניסת ה- AcLDL הנגרמת ע"י נעשית דרך מנגנון התלוי MAL MAL ברצפטור CD14 ובחלבוני האדפטור ו- MyD88 אך במקרה זה ישנה תלות ב- TLR4 ולא CD14 וחלבוני לעומת זאת גורם להגברה בבליעת ה- LDL באופן התלוי ב- F. nucleatum.tlr2 TLR2, TLR4,MyD88 האדפטור MAL ו- אך להפתעתנו ללא מעורבות של הרצפטורים ו- TLR9. בשונה מהשפעתו על בליעת.F nucleatum,ldl גורם להגברה בבליעת ה- AcLDL באופן שאינו תלוי ברצפטורים TLR9,TLR2,TLR4 ו- CD14 כמו כן ללא מעורבות של חלבוני האדפטור MAL ו-.TLRs ולכן יתכן שתהליך זה אינו תלוי ב- MyD88 הראנו שרמות ביטוי Scavenger receptors עולות בעקבות חשיפה לפתוגן.F. nucleatum עליה זו F. מהווה מנגנון אפשרי המסביר את ההגברה בכניסת ה- AcLDL LDL/ בעקבות חשיפה ל-.nucleatum סדרת מעכבים כנגד רצפטורים, קינאזות ופקטורי שיעתוק המעורבים בשרשרת העברת הסיגנל בתא F. שימשו אותנו לחקר שרשרת האירועים העומדים מאחורי כניסת LDL ו- AcLDL המתווכת ע"י F. בשרשרת העברת הסיגנל המתרחשת כאשר התא קולט LDL )ללא חשיפה ל.nucleatum NFkB פקטור השיעתוק,PI3K, PKCα,β, הראנו שישנה מעורבות של הקינאזות p38 )nucleatum LDL ואף מעורבות חלקית של.Scavenger receptors בתהליך כניסת אשר מוגבר בעקבות p38,scavenger receptors חשיפה ל- nucleatum.f ישנה מעורבות של הקינאז ופקטור השיעתוק.NFkB אין מעורבות של PI3K ו- PKCα,β. נראה כי מבין כמה מסלולים הפועלים בו זמנית בתהליך קליטת LDL )שחלקו נייטיבי וחלקו עבר מודיפיקציות(,.F nucleatum מגביר מסלול אחד הגורם לקליטה מוגברת של LDL שעבר מודיפיקציות על ידי.Scavenger receptors בשרשרת העברת הסיגנל המתרחשת כאשר התא קולט AcLDL )ללא חשיפה ל-.F( nucleatum ישנה מעורבות של,Scavenger receptors הקינאז p38 ופקטור השיעתוק NFkB אך אין מעורבות 6

7 NFkB p38,scavenger receptors של PI3K ו- PKCα,β. באופן מעניין אותם הפקטורים: ו- מעורבים בקליטת AcLDL לאחר חשיפה ל-.F nucleatum כך שנראה ש-.F nucleatum מגביר קליטת AcLDL ע"י הגברת ביטוי.Scavenger receptors מסקנות:.P gingivalis גורם להגברה בצבירת ליפופרוטאינים במקרופאגים ובכך מוביל ליצירת תאי TLR4 TLR2 קצף באופן התלוי ב- או )תלוי בסוג המודיפיקציה של הליפופרוטאינים( ובחלבוני F. nucleatum.myd88 האדפטור MAL ו- חשיפה ל- גורמת להגברה גדולה יותר בצבירת ליפופרוטאינים במקרופאגים בהשוואה לחשיפה עם.P gingivalis וב- MOI )יחס חיידק פר תא( נמוך יותר..F nucleatum גורם להגברה בצבירת LDL במקרופאגים באופן התלוי ב- CD14 וחלבוני האדפטור F. nucleatum עם זאת, TLR4,TLR2 ו- MyD88 אך אינו תלוי ב- ו- TLR9. גורם להגברה MAL בבליעת ה- AcLDL באופן שאינו תלוי ברצפטורים TLR9,TLR2,TLR4 ו- CD14 אין מעורבות של חלבוני האדפטור MAL ו- MyD88 ויתכן שתהליך זה אינו תלוי ב-.TLRs הדבקה עם.F nucleatum )AcLDL LDL( גורמת להגברת Scavenger receptors ביטוי וכניסת ליפופרוטאינים מוגברת וגם נעשית באופן התלוי ב- p38 ופקטור השיעתוק.NFκB הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים מאחורי יצירה מוגברת של תאי קצף בתגובה לפתוגנים האוראליים.P gingivalis ו-.F nucleatum עשויה להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שיגבילו את התקדמות טרשת העורקים ע"י זיהום כרוני אוראלי הקיים במחלות חניכיים. 7

8 תוכן עיניינים תקציר )עברית( תוכן עיניינים )עברית( רשימת קיצורים רשימת איורים מבוא 1.1 טרשת עורקים גורמים מיקרוביאלים המקושרים עם טרשת עורקים ומחלות קרדיווסקולריות מעורבות פתוגנים אוראליים בטרשת עורקים מחלה פריודונטית הפתוגנים האוראליים Porphyromonas gingivalis ו- nucleatum Fusobacterium ומעורבותם בטרשת עורקים משפחת ה- (PRR) Pattern recognition receptors ומערכת החיסון המולדת משפחת ה Toll like receptors שרשרת העברת הסיגנל של...19 TLRs משפחת ה- (SR) Scavenger receptors הקשר בין SR לבין... TLRs מעורבות TLRs בטרשת עורקים מטרת המחקר תת מטרות שיטות וחומרים תוצאות פרק I I.1 מעורבות החיידקים.P gingivalis ו-.F nucleatum ביצירה מוגברת של תאי קצף F nucleatum ו-.P gingivalis טיפול עם בעקבות ו- AcLDL LDL כניסה מוגברת של I.2 I.3 מעורבות PRRs וחלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה לחיידקים P. gingivalis ו- nucleatum F. I.1.3 מעורבות חלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה לחיידקים P. gingivalis ו- nucleatum F F nucleatum המושרה ע"י LDL בתהליך כניסת התפקיד של MyD88 I.4 I.5 מעורבות PRRs וחלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה לחיידקים P. gingivalis ו- nucleatum F. פרק II I.1.5 מעורבות חלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה לחיידקים P. gingivalis ו- nucleatum F F nucleatum המתווכת ע"י LDL/ AcLDL שרשרת העברת הסיגנל המובילה להגברת כניסת ה- 1.II 1.1.II מעורבות הפקטורים PI3K, PKCα,β, p38 ו- NFκB בכניסת LDL ספונטנית וכניסה מוגברת בעקבות אינטראקציה עם F nucleatum 8

9 2.1.II מעורבות הפקטורים PI3K, PKCα,β, p38 ו- NFκB בכניסת AcLDL ספונטנית וכניסה מוגברת בעקבות אינטראקציה עם F nucleatum.f nucleatum 2.II גורם להגברה בביטוי Scavenger receptors על פני שטח התא II מעורבות Scavenger receptors ו- Lipid rafts בכניסת LDL ספונטנית וכניסה מוגברת המתווכת ע"י F. nucleatum 2.3.II מעורבות Scavenger receptors ו- Lipid rafts בכניסת AcLDL ספונטנית וכניסה מוגברת המתווכת ע"י F. nucleatum f nucleatum על הכרות והתגובה של מקרופאגים ל- השפעת DxSO4 4.II פרק III...63.F nucleatum תגובת המאכסן לזיהום תת עורי של 1.III...63.F nucleatum בתגובת המאכסן לזיהום תת עורי של TLR4 ו- מעורבות הרצפטורים TLR2 1.1.III F nucleatum בתגובת המאכסן לזיהום תת עורי של מעורבות הרצפטור TLR III F nucleatum בתגובת המאכסן לזיהום תת עורי של מעורבות הרצפטור TLR III...67.F nucleatum איתגור עם לאחר אפיון אוכלוסיות התאים ב- chamber 1.III 1.2.III צביעת אוכ' התאים ב- chamber ל- Gr-1 ול- Ly6-G 24h לאחר איתגור עם F. nucleatum 2.2.III צביעת אוכלוסיית התאים ב- chamber ל- Gr-1 CD11b,,F4/8 ול- NK1.1 24h לאחר איתגור עם F. nucleatum...7 in vitro.f nucleatum מנגנון ההכרות והתגובה של מקרופאגים ל- 3.III תלויה בחלבון האדפטור MyD88.F ע"י מקרופאגים בתגובה ל- nucleatum TNFα יצירת 1.3.III אך לא ב- TLR2 ו- TLR4 ובחלבון האדפטור TRIF תלויה בחלבון האדפטור MyD88.F ע"י מקרופאגים בתגובה ל- nucleatum NO יצירת 2.3.III אך לא ב- TLR2 ו- TLR4 ובחלבון האדפטור... TRIF WT הסרת אוכלוסיית המקרופאגים בעכברי 3.3.III WT אפיון אוכלוסיות התאים לאחר הסרה של אוכלוסיית המקרופאגים בעכברי III III הסרה של אוכלוסיית מקרופאגים in vivo אינה משפיעה על יצירת TNFα לאחר חשיפה לחיידק F. nucleatum.5 דיון רשימת ספרות תוכן עינינים )אנגלית( תקציר )אנגלית( 9

10 רשימת קיצורים AcLDL- Acetylated LDL ApoE- Apolipoprotein E ChonSO4- Chondroitin sulfate A sodium salt DiI-1,1'Dioctadecyl-3,3,3',3'tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate DxSO4- Dextran sulfate sodium salt GPI- Glycosylphosphatidylinositol LDL- Low density lipoprotein IFNγ- Interferon γ IL-1- Interlokine 1 IL-1β- Interlokine 1β LDL- Low density lipoprotein LDLRc- LDL receptor LPS- Lipopolysaccharide LRR- Leucin rich repeats LXR- liver X receptor MβCD- Methyl-β-cyclodextran MyD88- Myeloid differentiation factor 88 mmldl- Minimally modified LDL MMPs- Matrix metalloproteinases NFκB- Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NK cells- Natural killer cells OxLDL- Oxidized LDL PAMP- Pathogen associated molecular pattern PDL- Periodontal ligament PI3K- Phosphatidylinositol 3-kinase PKC α,β - Protein kinase C α and β 11

11 PRR- Pattern recognition receptors SR- Scavenger receptors SR-A1- Scavenger receptor type 1 TIR- Toll /IL-1 receptor domain TIRAP/ MAL- TIR domain containing adaptor protein/ MyD88 adapter like TLRs- Toll like receptors TNFα- Tumor necrosis factor α TRIF- TIR domain containing adaptor protein inducing IFNβ TRAM- TRIF-related adapter molecule/ TIRP-TIR-containing protein -או TICAM-2 11

12 רשימת איורים איור מס' 1: יצירת תאי קצף לאחר טיפול בחיידקים.P gingivalis ו- nucleatum.f. איור מס' 1: טטרצית ריכוזי DiI-LDL ו-.BODIPY FL AcLDL איור מס' 3: כניסה מוגברת של LDL/ AcLDL בעקבות טיפול עם.P gingivalis ו- nucleatum..f איור מס' 4.1: מעורבות הרצפטורים TLR2 ו- TLR4 בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis איור מס' 4.1: מעורבות הרצפטורים TLR2.F. nucleatum ו- TLR4 בהגברת כניסת LDL איור מס' 5.1: מעורבות CD14 בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis בעקבות חשיפה ל- איור מס' 5.1: מעורבות CD14 ו- TLR9 בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum איור מס' 6.1: מעורבות חלבוני האדפטור -/- MyD88 MAL -/-, ו- -/- TRIF בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis איור מס' 6.1: מעורבות חלבוני האדפטור -/- MyD88 MAL -/-, ו- -/- TRIF בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum איור מס' 7: מדידת כניסת LDL לתאי MyD88-/- לאחר טיפול עם מדיום שנאסף מתאי RAW שנחשפו ל-.E.coli LPS איור מס' 8.1: מעורבות TLR2 ו- TLR4 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis איור מס' 8.2: מעורבות TLR2 ו- TLR4 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum איור מס' 9.1: מעורבות CD14 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.P gingivalis איור מס' 9.1: מעורבות CD14 ו- TLR9 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum איור מס' 1..1: מעורבות חלבוני האדפטור MAL, MyD88 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.gingivalis איור מס' 1..1: מעורבות חלבוני האדפטור MAL, MyD88 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.nucleatum איור מס' 11: השפעת מעכבים כנגד PI3K, PKCα,β, p38 ו- IκB-α מוגברת בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum איור מס' 11: השפעת מעכבים כנגדp38 ו- IκB-α בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum על כניסת AcLDL P. F. על כניסת LDL ספונטנית וכניסת LDL ספונטנית וכניסת AcLDL מוגברת איור מס' 13: ביטוי Scavenger receptors על פני שטח התאים בעקבות טיפול עם..F nucleatum איור מס' 14: השפעת המעכבים DxSO4 ו- MβCD על כניסת LDL ספונטנית וכניסת LDL מוגברת בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum איור מס' 15: השפעת המעכבים DxSO4 ו- MβCD על כניסת AcLDL ספונטנית וכניסת AcLDL מוגברת בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum איור מס' 16: השפעת DxSO4 על הכרות והתגובה של מקרופאגים ל-.F nucleatum איור מס' 17: יצירת IL-1 TNFα, ו- IL-1β לאחר זיהום עם.F nucleatum בעכברי -/- TLR2 איור מס ' 18: יצירת IL-1 TNFα, ו- IL-1β לאחר זיהום עם.F nucleatum בעכברי -/- TLR4 איור מס ' 19: צביעת Gr-1 ו Ly6-G לתאים שנאספו מה- chamber 24h לאחר איתגור עם.F. nucleatum איור מס'.1: צביעה של אוכלוסיות התאים בחלל ה- chamber למרקרים תאיים. איור מס' :11 יצירת TNFα במקרופאגים פריטונאלים מעכברי -/- TRIF WT, TLR2 -/-, TLR4 -/-, MyD88 -/-, לאחר חשיפה ל- nucleatum.f. 12

13 -/- TRIF -/- MyD88 WT, TLR2 -/-, TLR4 -/-, ו איור מס' :11 יצירת NO במקרופאגים פריטונאלים מעכברי לאחר חשיפה ל- nucleatum.f. איור מס' 13: צביעה למרקרים תאיים של אוכלוסיות התאים ב- chamber בעכברי WT ועכברי WT שעברו depletion למקרופאגים. איור מס' 14: יצירת TNFα לאחר איתגור עם.F nucleatum בעכברי,WT ועכברי WT שעברו Depletion למקרופאגים..F nucleatum מגביר כניסת LDL ו- AcLDL לתוך איור מס' 15: סכמה המתארת את המנגנונים דרכם התאים. 13

14 1.מבוא 1.1 טרשת עורקים: טרשת עורקים )Atherosclerosis( היא הגורם העיקרי למחלות לב כליליות ולשבץ מוחי אשר יחד מהווים את הגורם הנפוץ ביותר לתמותה בחברה המערבית, כחמישית מתמותת בני האדם בעולם 2[. במהלך העשור האחרון נעשה שינוי מהפכני בהבנת המנגנונים המעורבים בהתפתחות,1[ והתקדמות טרשת עורקים. דבר שהוביל להכרה הגוברת שטרשת עורקים היא מחלה דלקתית] 3 [. T תחילת המחלה מאופיינת באינטראקציות בין ליפופרוטאינים, תאי אנדותל, מקרופאגים, תאי ואלמנטים של דופן כלי הדם. תהליך דלקתי זה יכול להוביל בסופו של דבר להתפתחות נגעים טרשתים ופלאק אתרוסקלרוטי הגורמים להצרות חלל כלי הדם. עם התקדמות התהליך הפלאק האתרוסקלרוטי עלול להיקרע ויוצר קריש דם. תוצאות תהליכים אלו עלולות להסתיים בסיבוכים קליניים כדוגמת אוטם שריר הלב ושבץ] 2 [. התהליך הראשוני בפתוגנזה של המחלה הוא אי תפקוד של תאי האנדותל המצפים את כלי הדם. חוסר התפקוד של תאי האנדותל יכול להגרם ע"י גורמים רבים כגון: ליפידים, זיהום בקטריאלי או ויראלי. ציטוקינים, רדיקלים חופשיים, - Lipoprotein) (Low Density הינו אחד הנשאים העיקריים של כולסטרול וכולסטרול- אסטר LDL 2-22% apo-b1 בפלסמה וגודלו.26nm נשא זה מכיל את החלבון המהווה ממשקלו, טריגליצרידים 1-15%, פוספוליפידים 2-28%, כולסטרול אסטר 37-48%, וכולסטרול 8-1%. תאי אנדותל משופעלים מעלים ביטוי של מולקולות הדבקות על פני שטח התא ובכך מאפשרים גיוס של מונוציטים לחלל הסב-אנדותליאלי. בנוסף ה- LDL נקלט ע"י תאי האנדותל ועובר שינויים מבניים (minimally mmldl על ידם או בחלל הסב-אנדותליאלי. שינויים אלא כוללים שינויים קלים.)ox-LDL- modified LDL( ועד לשינויים נרחבים כמו חימצון מלא של הנשא modified LDL) האינטראקציה של תאי האנדותל עם ה- LDL מובילה גם היא לביטוי של מולקולות הדבקות וציטוקינים דלקתיים. 14

15 מונוציטים נודדים לחלל הסב-אנדותליאלי ועוברים התמיינות למקרופאגים] 2, 4[. קליטת ה- mmldl ע"י המקרופאגים נעשית באחד משלושה דרכים: דרך ה- LDLR, דרך ה- Scavenger receptors או דרך פינוציטוזיס. ה- LDL על נגזרותיו השונות עובר בתאים פירוק ליזוזומלי, והכולסטרול החופשי ACAT-1 שנוצר בתוך המקרופאגים מומר לכולסטרול אסטר ע"י האנזים מה שמעניק לתאים אלו )Foam cells(.]5 מראה קצפי] 2, 4, תאים אלו נקראים תאי קצף בשל הכמויות הגדולות של כולסטרול אסטר שהם מכילים. תאי קצף הם אחד המאפיינים העיקרים של נגעים טרשתיים מוקדמים ומאוחרים. קיים בתאים גם תהליך הפוך של הוצאת הכולסטרול מן התאים שנקרא RCT- reverse cholesterol הכולסטרול-אסטר עובר המרה לכולסטרול ע"י האנזים NCEH והוא מוצא החוצה מן.transport.]4[HDL התא ע"י הנשאים ABCG1, ABCA1 שמעבירים אותו לנשאים חוץ תאיים כגון במקרופאגים שהפכו לתאי קצף השיווי משקל בין הכנסה של LDL לתאים לבין הוצאתו מופר לטובת הכנסה מוגברת של LDL לתוך התאים. הצטברות ליפידים בתאים וכניסה מוגברת של מונוציטים מובילה ליצירה הדרגתית של atheroma )דלקת בחלל הסב-אנדותליאלי( ותוצאתו של תהליך זה היא הצרות של חלל כלי הדם. בשלבים מתקדמים יותר של המחלה הולכת וגוברת הצטברות תאי הקצף, וישנה נדידה של תאי.)Fibrous plaque( שריר חלק )SMC( מהחלק המדיאלי של קיר כלי הדם ויצירת פלאק פיברוטי בהמשך נוצרת תגובה דלקתית של מקרופאגים, תאי אנדותל, תאי שריר חלק ותאי T שמגיעים לאזור הסב-אנדותליאלי. נגעים מתקדמים של טרשת עורקים מתאפיינים באפופטוזיס של מקרופאגים, ותאי שריר חלק, אשר גורם ליצירת ליבה נקרוטית. שחרור תוכן התאים, המכיל בתוכו מטלופרוטאינזות גורם לפירוק המטריקס החוץ תאי. תהליך זה גורם לאי יציבות הפלאק ואף קריעה שלו. לאחר קריעת הפלאק ישנה חשיפה של Tissue factor לזרם הדם אשר גורמת ליצירת קריש דם וגוררת סיבוכים קליניים כגון אוטם שריר הלב ושבץ ]2, 5[. 4, 15

16 1.1 גורמים מיקרוביאלים המקושרים עם טרשת עורקים ומחלות קרדיווסקולריות: טרשת עורקים הינה מחלה המאופיינת ע"י דלקת כרונית, מכיוון שכך נבדקה ההשערה שפתוגנים היוצרים דלקת כרונית עשויים להשפיע על התפתחות טרשת עורקים. דוגמא למעורבות פתוגן בתהליכים המקדמים טרשת עורקים היא החיידק.Chlamydia pneumonia חיידק זה זוהה בפלאק האתרוסקלרוטי ע"י,PCR צביעות אימוהיסטוכימיות, ומיקרוסקופ אלקטרוני] 6, 7[ חיידק זה גם בודד מתוך נגעים טרשתיים וגודל,6[in vitro 8[. או-/- ApoE הם עכברים שמפתחים טרשת עורקים באופן ספונטני בעקבות רמות עכברי LDLR-/- גבוהות של ליפידים בדם] 9, 1[. בעבודות שנעשו בעכברי LDLR-/- או-/- ApoE שהודבקו בפתוגן זה, המחלה התפתחה באופן מואץ זאת בהשוואה לעכברים שלא הודבקו בפתוגן] 11, 12[. מחקרים נוספים מצביעים על מעורבותו של חיידק זה בהאצת ספיחה וכניסה מוגברת של LDL למקרופאגים ועל ידי כך השפעה על הפיכתם לתאי קצף] 13 [. בשנים האחרונות התפרסמו מחקרים המצביעים על מנגנון אפשרי למעורבות Chlamydia בתהליכים המקדמים טרשת עורקים. דוגמא למאמר מסוג זה היא מחקר המראה pneumonia.]14[ TLR2 שהפתוגן Chlamydia pneumonia גורם ליצירת תאי קצף דרך הרצפטור במחקר Chlamydia pneumonia נוסף שנעשה ע"י Chen ושותפיו, הראו שהפתוגן מערב את שני הרצפטורים TLR2, TLR4 בזיהוי שלו ע"י המערכת החיסונית המולדת. העברת הסיגנל נעשית דרך שני חלבוני האדפטור TRIF ו MyD88 )עליהם ארחיב בהמשך(. במאמר נוסף של קבוצת חוקרים זו, מראים שטיפול עם אגוניסט לרצפטור הגרעיני receptor),lxr (liver X מעכב את הפעלת פקטור השיעתוק IRF3 ואת הסיגנל תלוי.TLR כתוצאה מכך מוגברת זרימת הכולסטרול החוצה מן התא ע"י הטרנספורטר ABCA1 ולמעשה יש פחות יצירה של תאי קצף] 15, 16[. ישנם פתוגנים נוספים המקושרים עם טרשת עורקים ומחלות קרדיווסקולריות. דוגמאות לפתוגנים מסוג זה: Helicobacter pylori, Cytomegalovirus, Epstein- Barr virus, Herpes simplex viruses 1 (HSV1), HSV2, Hepatitis B, Hepatitis C. 16

17 1.1.1 מעורבות פתוגנים אוראליים בטרשת עורקים: מחקרים רבים מצביעים על הקשר בין זיהומים פריודונטלים לבין מחלות סיסטמיות כדוגמת טרשת עורקים ומחלות של כלי הדם] 17, 18[. ישנם מחקרים אפידמיולוגים התומכים בקשר בין מחלות פריודונטליות לבין טרשת עורקים] 17, 18[. הרעיון המרכזי העומד מאחורי מחקרים אפידמיולוגים אלו הוא שאותו פתוגן הגורם לזיהום כרוני מגיע לזרם הדם ומשם לדופן כלי הדם בשלבים מוקדמים או מאוחרים של יצירת הנגע הטרשתי. כך שהוא באופן ישיר משפיע על תהליכים המקדמים טרשת עורקים כמו הפיכת מקרופאגים לתאי קצף או מעורבות בפירוק הפלאק האתרוסקלרוטי. כאמור, הפלאק האתרוסקלרוטי אינו סטרילי, זוהו בו פתוגנים רבים כגון חיידקים ווירוסים. ועל כן אחד הרעיונות העומדים מאחורי מחקרים אלו הוא שהפתוגן המחולל דלקת כרונית באתר מרוחק משפיע על התקדמות המחלה טרשת העורקים דרך שיחרורם של ציטוקינים ומדיאטורים אינפלמטורים כגון הנוצרים בדלקת הכרונית לזרם הדם. באופן זה פתוגנים המעורבים בדלקת כרונית עשויים CRP לקדם תהליכים דלקתיים באזורים מרוחקים יותר ממקור הדלקת. 1.3 מחלה פריודונטלית: מחלות חניכיים הינן מחלות זיהומיות אשר נגרמות ממיקרואורגניזמים שמתיישבים על פני משטחי השיניים מעל או מתחת לשולי החניכיים. 7 זנים שונים יכולים להתיישב בחלל הפה, כאשר בכל אדם יש כ- 15 זנים שונים. המחלה נגרמת משינוי בשווי המשקל בין הפלורה של חלל הפה לבין מערכת החיסון של הגוף, אשר יכול להוביל לתהליך ההרסני של מחלת החניכיים. מחלות חניכיים הינן שם כולל לקבוצה של מחלות אשר מערבות את הרקמות הפריודונטליות. רקמה פריודונטלית כוללת רקמות מסויידות של צמנטום ע"ג שורשי השיניים ועצם אלוואולרית בלסתות, )PDL( ורקמת חיבור רכה של periodontal ligament אשר מתווכת בין שתי הרקמות המסויידות. מחלות חניכיים הן מחלות זיהומיות ומאופיינות בתהליכים דלקתיים כרונים או אקוטיים ברקמות הפריודונטליות השונות. עם התקדמות המחלה תתרחש ספיגה המשכית של מנגנון התאחיזה של השיניים )החל מהצד הכותרתי של השיניים עם המשכיות עד לקצה השורשים(, תהליך זה יוביל 17

18 לחשיפת שורשי השיניים לחלל הפה ובסופו של דבר לחסר תמיכה גרמי בשיניים ואובדן שיניים. מחלה פריודונטלית היא הזיהום הכרוני השכיח ביותר באוכ' ההומנית. Fusobacterium nucleatum ו Porphyromonas הפתוגנים האוראליים gingivalis ומעורבותם בטרשת עורקים: הינו חיידק גראם שלילי בעל צורת Rod )מתג קצר(, אנאירובי אובליגטורי, אינו נייד P. gingivalis ואינו יוצר ספורות. החיידק משויך למשפחת black pigmented bacteroides אשר מייצרים מושבות שחורות על מצע אגר דם..P gingivalis ביותר] 19 [. הינו החיידק הכי מקושר למחלת חניכיים וגם הנחקר לחיידק P. gingivalis יש גורמי אלימות רבים, כגון יכולת הידבקות לרקמות בחלל הפה בעזרת פימבריה (Fimbriae) )אשר תפקידה לאפשר קישור לחיידקים אחרים, תאי אפיתל ומשטחי שן(,.]21 המגלוטינין )חלבון חוץ ממברנלי עם אפיניות לאריתרוציטים(] 2, כמו כן גם קפסולה אשר מאפשרת התחמקות ממע' החיסון של המאכסן וקשרי קו-אגרגציה )קישור לחיידקים אחרים בחלל הפה(. בנוסף, לחיידק יש כמה גורמי אלימות הרסניים לרקמה כגון קולאגנאז, פרוטאזות והמוליזין ]2[, וקבוצה של ציסטאין-פרוטאזות בשם gingipains המהווה 85% מהפעילות הפרוטאוליטית של החיידק ובעלת יכולת פירוק של גורמי מאכסן שונים כגון ציטוקינים, נוגדנים וכיוב'] 22 [. קבוצת פרוטאזות זו כוללת את RgpA, RgpB וכן.Kgp כפי שנאמר קודם לכן הזיהום הכרוני השכיח ביותר באוכלוסיה ההומנית הוא מחלה פריודונטלית. ומאחר וחיידק זה מזוהה כאחד הגורמים העיקריים במחלה פריודונטלית נבדקה מעורבותו בתהליכים המקדמים טרשת עורקים. ישנן עדויות רבות המצביעות על מעורבות.P gingivalis בתהליכים המקדמים טרשת עורקים. בראש ובראשונה ישנם מחקרים אפידמיולוגים המצביעים על קשר בין מחלות חניכיים לבין טרשת עורקים] 17, התפתחות מודלים לטרשת עורקים בחיות חיזקה את העובדה שהחיידק.]24,23,18 oral infection תורם להתפתחות טרשת עורקים. במחקר בו השתמשו במודל של P. gingivalis עם החיידק בעכברי )עכברים אשר מפתחים באופן ספונטני טרשת ApoE -/- P. gingivalis 18

19 עורקים] 9, 1[(. החוקרים הראו שקבוצת העכברים שנחשפה לחיידק פיתחה טרשת עורקים באופן מואץ יותר מקבוצת הביקורת שלא נחשפה לחיידק ], 26[. במחקר נוסף אותה קבוצת חוקרים מראה ש-.P gingivalis נבלע ע"י מקרופאגים וגורם להגברה.]28 בצבירת LDL ובכך מקדם את הפיכתם לתאי קצף] 27, עבודות נוספות הראו שהחיידק בעל יכולת הצמדות וחדירה לתאי אנדותל של אבי העורקים.]29[(HAEC) (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin) גורם לתאי האנדותל לבטא מולקולות הדבקות.P gingivalis ולהפריש כימוקינים וציטוקינים IL-1β) (IL-8, MCP-1, דלקתיים שמושכים מקרופאגים אליהם וכך MMPs למעשה מתחילה נדידת מקרופאגים לחלל הסב-אנדותליאלי] 3 [. מטריקס מטלופרוטאינזות הינם קבוצה של אנזימים האחראיים על פירוק רב חלבוני המטריקס ברקמה. יש להם תפקיד חשוב בפתולוגיה של מחלות קרדיווסקולריות ומחלות כלי דם של הלב] 31 [. MMP-8 ו- MMP-9 מעורבים בהרס הרקמתי 33[. במחלת חניכיים] 32, במחקר נוסף השתמשו במודל של תרבית תאי אפיתל ותרבית תאי מקרופאגים אותם חשפו לזיהום בודד או משותף של החיידקים gingivalis,.p או חשיפה ל- LPS שלהם ומצאו שישנו יצור מוגבר של Tanarella forsythia, T.denticola ציטוקינים דלקתיים וכן יצירה של.MMP9 דבר התורם להרס הרקמה במחלה פריודונטלית] 34 [. כפי שצויין לחיידק.P gingivalis יש מגוון רחב של פרוטאזות ויכולת פרוטאוליטית ענפה. במחקר Fibruos 21 הראו ש- P. gingivalis שנעשה ע"י Kuramitsu ושותפיו בשנת מפרק דגימות של וכמו כן חשיפה של חיידק זה למקרופאגים גורמת לעליה ביצור של MMP9 ע"י,cap המקרופאגים] 35 [. P. gingivalis במחקרים נוספים הראו שישנה נוכחות של DNA של ו- rrna בנגע הטרשתי] 36 [ וישנו מחקר נוסף בו הראו על ידי צביעות שנעשו במקרוסקופ קונפוקלי את החיידקים.P gingivalis ו- actinomycetemcomitans Aggregatibacter חיים בנגע הטרשתי] 37 [. זוהו בפלאק האתרוסקלרוטי כמה סוגי בקטריות המקושרות עם מחלה פריודונטלית ובינהם: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Prevotella.]38[P. gingivalis ו- F. nucleatum וכן intermedia 19

20 .F nucleatum הינו חיידק גראם שלילי בעל צורת,Rod אנאירובי, אינו נייד ואינו מייצר ספורות. הוא נחשב לפתוגן פריודונטלי עיקרי] 39 [..F nucleatum הינו החיידק הנפוץ ביותר באתרים בריאים בחניכיים, כמותו עולה בצורה משמעותית באתרים חולים כגון: בפלאק התת חניכי של דלקת חניכיים או בכיסים פריודונטלים. חיידק זה נחשב אורגניזם מתווך בין חיידקים שהם early colonizers )בדרך כלל חיידקים אירובים גראם חיוביים( late colonizers לבין )בדרך כלל חיידקים אנאירובים גראם שליליים( ומכאן חשיבותו הרבה ביצירת הפלאק הדנטלי] 4 [. חיידק זה מאפשר לחיידקים אחרים עם יכולות קישור מוגבלות להיקשר לחיידקים אחרים המרכיבים את הפלאק ולרקמות האוראליות דרך אינטראקציה של קו-אגרגציה] 4 [. קו-אגרגציה היא קישור בין חיידקי ספציפי, תופעה ייחודית לחיידקים..F nucleatum מבטא מגוון רחב של מולקולות הדבקות המאפשר קו-אגרגציה עם רוב החיידקים האוראליים] 41, 42[. ישנה קו-אגרגציה ספציפית בין החיידק.F nucleatum לבין החיידק.P gingivalis הקישור נעשה בין שייר סוכרי לחלבון] 41 [. הממצאים הנ"ל מרמזים על השתתפות לא בטלה בתהליך היווצרות והתקדמות של המחלה הפריודונטלית. הוא אחד מזני החיידקים המקושרים עם זיהום תוך ריחמי] 43, 44[. ניתן לבודד F. nucleatum חיידק זה בתדירות של 1-3% ממי שפיר של נשים בלידות מוקדמות עם שיליה תקינה] [. F. nucleatum והוא זוהה ב- 83% מהלידות המוקדמות עם הפרדות שיליה] 45 [. זיהום בדם של בעכברות בהריון תוצאתו בזיהומים מקומיים של השיליה המובילים ללידה מוקדמת או לידה של עובר מת] 46, 47[. ל-.F nucleatum יש יכולות היצמדות וחדירה לתאי אפיתל ואנדותל ]46, in vitro 47[. F. DNA קישור וחדירה לתאי אנדותל נצפה גם in vivo בשיליות מודבקות של עכברים. של נמצא בדגימות פלאק אתרוסקלרוטי דבר המרמז על מעורבותו בהתפתחות טרשת nucleatum עורקים] 48 [. מעורבותו של חיידק זה בטרשת עורקים עדיין לא ברורה. החשיבות בהבנת המנגנון באמצעותו מעורבים בתהליכים המקדמים טרשת עורקים תסייע F. ו- nucleatum P. gingivalis בעתיד ליצור טיפולים שימנעו את התפתחות המחלה וכן להסיר את הפתוגנים האוראליים מרשימת גורמי הסיכון להתפתחות טרשת עורקים. 21

21 1.4 משפחת ה- (PRR) Pattern recognition receptors ומערכת החיסון המולדת זיהום מיקרוביאלי גורם להתחלת אינטראקציה בין הפתוגן למאכסן. פתוגנים מבטאים רכיבים מולקולריים בשם patterns),pamps (Pathogen associated molecular רכיבים אלו שמורים אבולוציונית ונחוצים לשרידות ולפתוגניות של אותו פתוגן. PAMPs מזוהים ע"י המאכסן באמצעות.(Pattern recognition receptors) -PRR משפחה של רצפטורים השמורים אבולוציונית בשם רצפטורים אלו מבוטאים בעיקר ע"י מקרופאגים ותאים דנדריטים. זיהוי ה- PAMPs מפעיל קשת רחבה של תגובות אנטי מיקרוביאליות דרך אינדוקציה של ציטוקינים דלקתיים, כמוקינים, אינטרפרון (IFNs) מסוג 1 וחלבונים אנטימיקרוביאלים המתווכים את חיסול הפתוגן. כיום ידוע שמשפחת ה- PRR מזהה גם מולקולות אנדוגניות המשתחררות מתאים שנפגעו או תאים מתים. משפחת ה- PRRs מורכבת מארבע תת משפחות של רצפטורים והן: (NLRs) Toll like receptors (TLRs), RIG-I like receptors (RLRs), NOD like receptors ו- Scavenger כיום משייכים למשפחה זו גם את משפחת ה-. C type lectin receptors (CLRs) receptors אשר עליה ועל משפחת ה- TLRs אפרט בהמשך ]49, 5[ משפחת ה- :Toll like receptors מערכת החיסון המולדת immunity) (innate מהווה את קו ההגנה הראשון כנד חדירת פתוגנים. (TLRs) הם רצפטורים של מערכת החיסון המולדת הם בעלי תפקיד מרכזי Toll like receptors בזיהוי פתוגנים, והם חלק ממשפחת ה.PRR- משפחת ה- TLRs התפתחה על מנת לזהות תבניות ספציפיות למיקרואורגניזמים הנקראים גם אותם המזוהים ע"י ה- TLRs כוללים PAMPs.PAMPs בתוכם ליפופרוטאינים, שומנים, חלבונים וחומצות גרעין הנגזרים מטווח רחב של חיידקים ווירוסים.,1.TLR1-TLR12 12 משפחת TLRs ההומנית מבוססת על רצפטורים אלו הם רצפטורים מסוג החלק החוץ תאי של רצפטורים אלא מכיל חזרות עשירות בלואיצין LLR- leucin reach repeats ובעל חשיבות רבה בזיהוי הפתוגן. החלק התוך תאי של רצפטורים אלו בעל דימיון רב למשפחת ה- ועל כן נקרא ה- TIR.TIR- Toll /IL-1 receptor domain מכיל חלקים שחשובים להמשך IL-1 העברת הסיגנל] [. 21

22 בעבר חשבו שרצפטורים אלו מבוטאים בעיקר ע"י תאים מציגי אנטיגן APC כגון מונוציטים ותאים דנדריטים. אך כיום ידוע שהם מתבטאים גם ע"י פיברובלסטים, תאי אפיתל, אנדותל ותאי מאסט]- 51 הרצפטורים TLR1, 2, 4, 5, 6 מתמחים בעיקר בזיהוי של רכיבים ממקור חיידקי. ואילו.]53 הרצפטורים TLR3, 7, 8, 9 מתמחים בזיהוי חומצות גרעין ממקור בקטריאלי או ויראלי. דוגמאות: TLR5.LPS TLR4.)dsRNA( תפקידו לזהות RNA דו גדילי מזהה בעיקר מזהה פלגלין TLR3 בקטריאלי. TLR9 חיוני לזיהוי רצפי DNA לא ממותלים (CpG) האופיינים לחיידקים] 54 [. הרצפטור TLR2 מזהה מגוון של רכיבים מיקרוביאלים כגון ליפופרוטאינים מיקרוביאלים, חומצה ליפוטאיכואית LTA) (lipoteichoic acid- המרכיבה את הפפטידוגליקן של חיידקים גרם חיוביים, ]51-53[zymosan וגם את החיידק.P gingivalis עפ"י עבודות קודמות שנעשו על ידינו וגם על ידי אחרים] [. רצפטור זה יחודי בכך שהוא יוצר הטרודימרים עם TLR1 או TLR6 ובכך מגדיל את CD36.]58 טווח הליגנדים שהוא מזהה] 52, 53, לאחרונה פורסם שהרצפטור מהווה קו-רצפטור ל- עובדה זו מעידה על קשר בין ליפידים אנדוגנים לבין מע' החיסון המולדת, ועל.]6,59[TLR2 מכניזמים אפשריים בהם זיהום מיקרוביאלי, משפיע על תהליכים המקדמים טרשת עורקים. משמש כקו-רצפטור של הרצפטורים TLR2 ו- TLR4 הוא חסר חלק טרנס ממברנלי המעורב CD14 GPI CD14 בשרשרת העברת הסיגנל] 53, 61[. מצוי בצורה מסיסה בסרום או כחלבון המעוגן לממברנה] 62 [. החלבון CD14 מעורב בתיווך תגובת TLR1/2 לליפופפטידים חיידקיים ע"י כך שהוא מגדיל את הקרבה הפיזיקלית של הליגנד להטרודימר TLR1/2 ובנוסף מתפקד כקו-רצפטור של.]64,63[ triacylated לזיהוי של הליגנדlipopeptide TLR2 TLR7- CD14 במחקרם של al. Baumann et שפורסם לאחרונה דווח כי יוצר אינטראקציה עם TLR9 במסלול תלוי MyD88 והוא חיוני ליצירת ציטוקינים דלקתיים. בנוסף CD14 יוצר אינטראקציה עם TLR9 החיונית ליצירת תגובה אימונית] 65 [. 22

23 שרשרת העברת הסיגנל של TLRs MyD88- מרבית ה- TLR חולקים שרשרת העברת סיגנל משותפת המבוססת בעיקר על האדפטור (88.(myeloid differentiation factor זהו חלבון אדפטור המשותף גם לחלק מהרצפטורים TLRs ממשפחת ה- IL-1R הוא משמש כמעט את כל משפחת ה- פרט ל- TLR3 והמסלול האלטרנטיבי של MyD88.TLR4 משפעל משפחה של קינאזות בשם IL-1R associated kinases tumour necrosis factor receptor associated factor 6 -TRAF6 הם משפעלים את - IRAKs והסיגנל מועבר לפקטור השיעתוק הגרעיני NFκB.NFκB עובר טרנסלוקציה לגרעין ומעלה ביטוי של.]54[IL-12 גנים רבים המעורבים בדלקת כגון IL-1β, TNFα ו- בנוסף במסלול זה )מסלול תלוי TIRAP- (TIR domain containing adaptor protein/ משתתף אדפטור נוסף בשם )MyD88,TLR2 זהו חלבון אדפטור המשותף לרצפטורים TLR4 ו- הוא MAL (MyD88 adapter like)) TLR3, TLR4 מתווך בין דומיין ה- TIR של הרצפטור לבין האדפטור.]66[MyD88 קיים מסלול נוסף אלטרנטיבי של העברת סיגנל אותו חולקים הרצפטורים והוא אינו TRIF (TIR- domain containing adaptor תלוי ב-.MyD88 במסלול זה משתתף האדפטור IFNβ) protein inducing המפעיל את פקטור השיעתוק IRF3 )שמעלה ביטוי גנים כגון )IFNβ ואת ל- TLR4 במסלול העברת הסיגנל שאינו תלוי ב- MyD88 ישנו אדפטור נוסף בשם -TRAM.NFκB TRAM.TRIF המתווך בין דומיין ה- TIR לבין האדפטור (TRIF-related adapter molecule) מפעיל את פקטור השיעתוק IRF3 שמעלה ביטוי גנים כגון IFNβ ויכול גם לעשות אינדוקציה לפקטור השיעתוק.]51-53[NFκB משפחת ה- (SR) :Scavenger receptors משפחת רצפטורים זו נקראה כך לראשונה ע"י Brown & Goldstein על מנת להבחין בין בליעה של ע"י מקרופאגים )דרך מנגנונים שלא מעוכבים ע"י הצטברות כולסטרול בתא( לבין modified LDL בליעת LDL הנעשית ע"י הרצפטור ל [LDL [. באזורים בהם תאי האנדותל של כלי הדם משופעלים, מונוציטים מגוייסים לחלל הסב-אנדותליאלי, מתמיינים למקרופאגים ומבטאים על פני שטח התא מגוון של רצפטורים ממשפחה זו המתווכים בליעה של.modified LDL שמה של המשפחה Scavenger receptors נובע מיכולתם להקשר ו"לבלוע" מגוון רחב של ליגנדים בעלי 23

24 anionic מודיפיקציות שהם ממקור עצמי או חיצוני כמו למשל תאים אפופוטוטים, רכיבים חיידקים, SR כיום רווחת גישה חדשה הסוברת ש- הם חלק.]69[ phospholipids, amyloid proteins ממשפחת ה- PRR שמתווכים את תגובת מערכת החיסון המולדת של המאחסן דרך הכרתם של ]7[. PAMPs לרצפטורים אלו יש תפקיד בהתחלת תהליכי אפופטוזיס, בפינוי של תאים אפופטוטים, ובזיהוי פתוגנים. משפחת ה- SR מחולקת ל- 8 תת משפחות של רצפטורים שאינם דומים במבנה אך לכולם תכונה משותפת אחת והיא יכולתם לקשור LDL שעבר מודיפיקציות. -class D,SR-B I/II, CD36 -class B,SR-A I/II/III להלן פירוט של תת המשפחות: -class A.CXCL16 -class G,SERC-I/II -class F,LOX-1 -class E,CD68 רצפטורים נוספים שהצטרפו למשפחה הם.FEEL-1, CD163 modified LDL CD36 הרצפטורים SR-A ו- הם הרצפטורים העיקרים האחראיים לבליעת מקליטת ה-.modified LDL והם אלו הנחשבים בעלי ההשפעה AcLDL) (OxLDL, כ- 75-9% הרבה ביותר ביצירת תאי קצף] 68, 71[. 69, חסימה של SR-A, CD36 הורידה באופן משמעותי את יצירת תאי הקצף אך לא תעלים אותה לחלוטין מה שמעיד כל כך שישנם רצפטורים אחרים התורמים לכניסת ה- LDL וגם מנגנונים אלטרנטיבים] 72 [. ישנם מסלולים מטאבולים נוספים המשפיעים על יצירת תאי קצף לא דרך ה-.Scavenger receptors מקרופאגים מושפעים ע"י סידרת ליגנדים שנקשרים לרצפטורים גרעינים כגון.LXR, RORα, PPARα/β/γ/δ הליגנדים של רצפטורים אלא הם מדיאטורים בעלי חשיבות פיזיולוגית כמו חומצות שומן )ליגנד ל- PPARα (, כולסטרול )ליגנד ל- ואוקסיסטרולים )ליגנד ל- 4[)LXR [. לכולם יש את הפוטנציאל לשנות את ביטוי הגנים של, )RORα המקרופאגים\תאי קצף כולל שינוי של פעילות ה- RS ועל כן הם מהווים מטרה תרפואטית לתרופות SR modifiedldl כנגד מחלות קרדיווסקולריות. דוגמה למסלול מטאבולי כזה: שנבלע ע"י ה- מפורק בליזוזום לכולסטרול וחומצות שומן. Cyp27 האנזים הופך את הכולסטרול ל- שהוא אחד מה- oxysterols המשפיעים על שינויים בשיעתוק של 27hydroxycholesterol המקרופאג דרך הרצפטור הגרעיני receptor).]4[ LXR (liver X 24

25 1.4.3 הקשר בין SR לבין :TLRs כיום ישנן עדויות על יצירת קומפלקסים של רצפטורים ממשפחת ה- TLRs ורצפטורים ממשפחת ה- LTA TLR2 ישנם שני מחקרים בהם הרצפטור CD36 תואר כקו רצפטור של ל- ו- TLR6.SR Staphylococcus aureus של החיידק וגם ל- MALP-2 של (lipoteichoic acid) amyloid-β במחקר שפורסם לאחרונה הראו שזיהוי של OxLDL ושל.]73,59[Mycoplasma.]74[ גורם ליצירה של קומפלקס הטרוטרימרי CD36- TLR4- TLR6 של הרצפטורים peptide במחקר אחר מוכיחים ש- LPS של החיידקים.H pylori ו-.P gingivalis משפעלים מקרופאגים דרך יצירה של קומפלקס הטרוטרימרי של הרצפטורים TLR2- TLR1- CD36 ביחד עם האינטגרין וכל זה נעשה בדומיינים של-.]6[Lipid raft ישנה עדות נוספת ליצירת קומפלקס CD11b/CD18 בין TLRs ורצפטורים ממשפחת ה- SR והיא שיתוף פעולה בין הרצפטור LOX-1 לבין TLR2 במהלך תגובה תאית לפתוגן.]75[Klebsiella pneumoniae 1.5 מעורבות TLRs בטרשת עורקים: נגעים של טרשת עורקים בדרך כלל נוצרים באזורים בהם ישנה הפרעה לזרימת הדם כמו התעקלות, התפצלות של כלי הדם לשניים או הסתעפות למספר ענפים לדוגמא: העיקול של קשת האאורטה. הראו בעבר שישנו ביטוי מוגבר של TLR2 בתאי אנדותל הנמצאים באזורים בעלי פוטנציאל LDLR-/- להתפתחות טרשת עורקים. אזורים אלו גם מאופיינים בגיוס מוגבר של מונוציטים בעכברי.]76[ מחקרים נוספים מראים הגברה בביטוי TLR,1,2 4 ע"י מקרופאגים, תאי אנדותל ותאי שריר חלק.]78,77[ בנגעים של טרשת עורקים עכברי שהודבקו ב- P.ginginalis ApoE-/- פיתחו את המחלה בצורה מואצת, וגם נצפתה הגברה בביטוי TLR2 ו TLR4 בנגעים] 26 [. TLR2 LDLR/ TLR2 -/- במחקר שנעשה בעכברי double knockout ל התברר שלרצפטור ישנו תפקיד בהשפעה על חומרת המחלה ושחסר מוחלט של הרצפטור TLR2 תוצאתו בירידה בגודל LDLR-/- TLR2 הנגעים של טרשת העורקים. בנוסף אקטיבציה של בעכברי ע"י הליגנד Pam 3 CSK 4 מגדילה באופן דרמתי את גודל הנגעים של טרשת העורקים ומקדמת את המחלה] 79 [.

26 עובדות אלו מספקות תובנה לגבי מכניזם פוטנציאלי דרכו זיהום מיקרוביאלי יכול להשפיע על חומרת המחלה. MyD88-/- בשני מחקרים נוספים עם עכברי ApoE-/- שהוכלאו עם הראו שבעכברים אלו ישנה ירידה של 6% בגודל הנגעים השל טרשת עורקים, וירידה של 75% בתסנין המקרופאגים ירידה בתכולת השומן בפלאק וירידה בביטוי סיסטמי של ציטוקינים וכמוקינים MCP-1) (IL-12, לעומת קבוצת הביקורת של עכברי,8[ApoE-/- 81[. דלקתיים TLR2-/- ApoE-/- כאשר ישנו חסר גנטי של TLR4-/- או בעכברי ישנה ירידה משמעותית בהתפתחות של טרשת הנגעים העורקים, תכולת השומן בפלאק, וירידה בתסנין המקרופאגים] 81 [. לאחרונה התפרסם מחקר שבו קבוצת החוקרים הראתה שהסיגנל המועבר דרך הרצפטור TLR2 NFκB והאדפטור MyD88 מפעיל את פקטור השיעתוק וישנה יצירה של מדיאטורים דלקתיים ואנזימים מפרקי מטריקס בטרשת עורקים, דבר המרמז על כך שהסיגנל המועבר דרך TLR2 משפיע על יציבות הפלאק וקריעתו] 82 [. ישנם אנשים שהם הטרוזיגוטים או הומוזיגוטים לשני polymorphisms) SNPs (single nucleotide והם בעלי שוני בדומיין החוץ תאי של TLR4 ועל כן אינם מגיבים ל- LPS. אוכלוסיית אנשים זו מוגנת בפני טרשת עורקים וארועים קרדיווסקולרים אחרים] 83 [ אך נושא זה עדיין שנוי במחלוקת. מחלת חניכיים הינה מחלה של זיהום כרוני הפוגעת בנתח רחב של האוכלוסיה, ומחקרים אפידמיולוגים הצביעו על הקשר בין מחלת חניכיים לבין טרשת עורקים. ישנה קשת רחבה של עדויות על מעורבותם של פתוגנים אוראליים בהתפתחות והאצה של טרשת עורקים, בעיקר על מעורבותו של הפתוגן.P gingivalis אך קיים מעט מאוד מידע לגבי המנגנון שדרכו פתוגן זה מאיץ את התפתחות המחלה ולגבי פתוגנים אוראליים אחרים שמשפיעים על התהליך האתרוסקלרוטי. הבנה טובה יותר P. של המנגנונים העומדים מאחורי יצירה מוגברת של תאי קצף בתגובה לפתוגנים האוראליים ו-.F nucleatum עשויה להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שיגבילו את gingivalis התקדמות טרשת העורקים ע"י זיהום כרוני אוראלי הקיים במחלות חניכיים. 26

27 1. מטרת המחקר חקר המנגנונים דרכם החיידקים האוראליים.P gingivalis ו- nucleatum.f משפיעים על תהליכים המובילים לטרשת עורקים. 1.1 תת מטרות P. קביעת מעורבות PRRs וחלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהשפעת החיידקים.1 gingivalis ו-.F nucleatum על בליעת ליפופרוטיאינים על ידי מקרופאגים. נבחן את מעורבותם של פתוגנים אלו בתהליכי כניסת LDL ו- AcLDL )המהווה סוג של TLRs לתוך התאים המובילים ליצירת תאי קצף. בנוסף, נבחן את מעורבות )modified LDL וחלבוני אדפטור ספציפיים בתהליכים אלו. F. AcLDL חקר שרשרת העברת הסיגנל של בליעת LDL ו- בעקבות חשיפה ל-.2.nucleatum השוואת מסלול זה למסלול העברת הסיגנל המעורב בבליעה ספונטנית של הבנת המנגנונים המובילים לכניסת LDL ו- AcLDL מוגברת בעקבות זיהום.LDL/ AcLDL עם.F. nucleatum 3. הבנת מנגנון ההכרות והתגובה של המאכסן להדבקה עם.in vivo -.F nucleatum נתמקד בבחינת מעורבותם של רצפטורים ממשפחת TLRs וחלבוני אדפטור ספציפיים בתהליך הזיהוי של.F nucleatum ע"י מערכת החיסון המולדת. 27

28 3. שיטות וחומרים (ATCC( זני חיידקים: P. gingivalis 381, F. nucleatum 1953 החיידקים גודלו במצע UK) (Wilkins Chalgren anaerobe broth, Oxoid Ltd., Basingstoke, בתנאים גידול Wilkins 48 5% CO 2 אנארובים ב- 37 C עם למשך שעות. החיידקים נשטפו שלוש פעמים ב- PBS. כימות.1 של החיידקים נעשה ע"י ספקטרופוטומטר - עבור.P gingivalis קריאת OD של באורך גל של קריאת OD של.26 באורך גל של 66nm F. nucleatum.1 1 ועבור שווה ל- CFU/ml 65nm שווה ל- 1 9 CFU/ml תאים ושורות תאים: במחקר זה השתמשנו בשורת תאי מקרופאגים ממקור עכברי בשם בנוסף נעשה שימוש בשורות תאי מקרופאגים פריטונאלים מחיות.(ATCC) RAW264.7.(BEI Resources (ATCC)) CD14 -/-, MAL -/-, TLR9 -/- החסרים בגנים הבאים: knockout 2.5ml מקרופאגים הפריטונאלים הופקו מעכברים בגילאי 1-16 שבועות ע"י הזרקה של Thioglycolate 4% ב- DDW (Fluid Thioglycollate medium, BD, Sparks, USA) לפריטונאום. כעבור ארבעה ימים העכברים הוקרבו והמאקרופאגים נאספו ע"י שטיפות של חלל הפריטונאום עם.(BODEN PTY, Port Elizabeth, South Africa) )5u/ml( המכיל Heparin התאים נזרעו PBS בפלטת cells/well( 12 wells ב- 1% DMEM וגודלו באינקובטור ב- 37ºC עם )5*1 5 2 CO 5% ל- Biological industries, 1% FCS DMEM עד לשימוש. כל התאים גודלו במדיום המכיל 16h (1units/ml, Biological (2µM, Biological industries) L-Glu,)Beit- Haemek, Israel) industries) (1µg/ml, Biological ב- 37ºC עם 5% Streptomycin ו- industries) Penicillin,.CO 2.]28[ פרוטוקול זה מבוסס ע"פ Giacona and Lalla עם שינויים קלים תאי :Foam cell assay 24h 12 נזרעו בריכוז של 1*5 5 cells/well על גבי זכוכית מכסה בפלטה של באריות. RAW264.7 לאחר מכן התאים נשטפים שלוש פעמים, ונחשפים למדיום DMEM 2% FCS המכיל את החיידקים בריכוזים שונים לאינקובציה של שעות. 16 קבוצות טיפול נוספות F. nucleatum או P.gingivalis (.5µg/ml, Sigma- E.coli LPS,(2µg/ml, Invivogen, Toulouse, France) כללו Pam 3 CSK 4 28

29 (1µg/ml, Weizmann institute of science, Rehovot, CpG ו-,Aldrich, Rehovot, Israel) (Biomedical human LDL בהמשך התאים נשטפים שוב, ומודגרים עם מדיום המכיל.Israel) 16 בריכוז 5µg/ml ל- שעות. לאחר שטיפה עם Technologies inc, Stoughton,MA, USA) (in 6% Oil red O וצביעה עם (Sigma) הדגימות עוברות קיבוע עם PFA 4% דק' ל- 2,PBS Sigma) isopropanol, לליפידים עם צביעה נגדית של (Sigma) Hematoxylin למשך 5 דק'. ניתוח של התוצאות נעשה ע"י מקרוסקופ אור. אחוז תאי הקצף בשדה המיקרוסקופ מחושב )מעל 1 טיפות ליפידים פר תא( מסך התאים בשדה. (Biomedical Technologies inc, BTI Human LDL הפקת :LDL נרכש מחברת USA) Stoughton,MA, או הופק מפלסמה טרייה של תורם בריא. Kbr 1.19 הפקת LDL מפלסמה בוצעה ע"י ריכוז הפלסמה לצפיפות של באמצעות תמיסת )בצפיפות 1.35( וסרכוז באולטרה צנטריפוגה ל- 24h ב- 4ºC. תוכן תחתית המבחנה עובר (Sigma) )1.35 ריכוז לצפיפות של 1.63 באמצעות תמיסת Kbr )בצפיפות ושוב סרכוז באולטרה צנטריפוגה ל 24h ב- 4ºC. הפרקציה העליונה בנוזל הינו ה- LDL היא נאספת ועוברת דיאליזה כנגד PBS ב- 4ºC ל- 24h וזאת על מנת להפטר מהמלחים. קביעת ריכוז חלבון נעשית באמצעות שיטת.Bradford סימון LDL עם :DiI (Invitogen, DiI- (1,1'Dioctadecyl-3,3,3',3'tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) USA) Molecular probs, Eugene, הומס ב- DMSO לריכוז של 15µl. 3mg/ml של Dil עורבב TRIS-Saline-EDTA.37 C ב- 16h עם 1ml של LDL למשך לאחר מכן הדגימה מורחפת בבופר לנפח של.2.5ml על מנת להפטר (2mM Tris,.9% NaCl and.1% EDTA, ph= 7.4) (GE PD-1 Desalting colum משאריות DiI חופשי וממלחים, הדגימה מועברת דרך קולונה BSA Bradford ריכוז LDL נקבע ע"י שיטת כאשר שימש.healthcare, Buckinghamshire,UK) כסטנדרט. (Harlan, Jerusalem, Israel) C57B6 WT עכברים: בעבודה זו השתמשנו בעכברי שהם מזן.C57BL6 TLR2 -/-,MyD88 -/-, TRIF -/-, TLR4 -/- ובעכברי Knockout על רקע של עכברי ה- Knockout הם מתנה נדיבה מפרופ'.S Akira מאוניברסיטת אוסקה, יפן. העכברים מוחזקים ביחידת 29

30 ה- SPF בבית הספר לרפואה בהדסה עין כרם. וכל הניסויים מאושרים ע"י ועדת האתיקה הממסדית. F 2 TLR2 -/- /TLR4 -/- עכברי Double- Knockout נוצרו ע"י סריקת דור של הכלאת נקבות מזן -/- TLR2 עם זכרים מזן -/-.TLR4 הגנוטיפים אומתו ע"י PCR ושימוש בסטים ספציפיים של פריימרים עבור כל,84[Knockout 85[. תאים נזרעו בפלטה של 12 באריות בריכוז של 5.5*1 cells/well :LDL/ AcLDL uptake assay למחרת התאים נשטפים והמדיום מוחלף ל- 2% DMEM המכיל את החיידקים או הליגנדים )כפי 16 שפורט בשיטת ה- )Foam cell assay לאינקובציה של שעות. לאחר שטיפות התאים עוברים (1ng/ml, BODIPY FL AcLDL (.5µg/ml) אינקובציה עם מדיום המכיל DiI-LDL או לאינקובציה נוספת של 16 שעות. לאחריה.Invitogen, Molecular probes, Eugene, USA).5% BSA (Sigma)) התאים נשטפים, מורחפים ב- buffer FACS ב- PBS (. ניתוח התוצאות נעשה במכשיר ה- FACScan.(BD) RAW264.7 צביעה ל- :Scavenger receptors תאי אשר עברו חשיפה לחיידקים או לליגנדים של TLRs למשך 16 שעות נשטפים ועוברים אינקובציה עם mouse IgG לשעה ב- 4ºC )blocking( (R&D ולאחריה אינקובציה עם נוגדן מונוקלונלי anti mouse SR-A1/ MSR-1 antibody (ebioscience, San anti mouse או נוגדן מונוקלונלי CD36 systems, Minneapolis, USA) Goat anti ב- 4ºC. דק' ל- 45 התאים נשטפים ועוברים אינקובציה עם נוגדן שניוני Diego, USA).5% FACS buffer (R&D Systems) המסומן ב- FITC לשעה ב- 4ºC ומורחפים ב rat IgG.(BD) FACScan נעשית ע"י מכשיר ה- אנליזה ב- PBS (. BSA (Sigma)) 5 5*1 12 RAW264.7 עיכוב :LDL/ AcLDL uptake תאי נזרעו בפלטת באריות בריכוז של,cells/well למחרת התאים נשטפים ועוברים השרייה עם המעכבים מורחפים ב- DMEM 2% למשך (Dextran שעה. כל המעכבים נרכשו מ- Sigma. -DxSO4 מעכב כללי של Scavenger receptors (Chondroitin sulfate משמש כביקורת ל- DxSO4 -ChonSO4, sulfate sodium salt, 1mM),(1µM) מעכב ל- P38 PD169316,(1µM) מעכב ל- P38 -SB22, A sodium salt, 1mM) -LY2942 מעכב ל- PI3K -BAY11-782,(2µM) מעכב ל- IκBα -Gö6976,(1µM) מעכב Methyl-β-cyclodextran,1mM).( מדידה -MCD ל- PKCα,β,(1µM) מעכב ל- rafts Lipid 31

31 DiI-LDL (.5µg/ml) AcLDL של ספיחת LDL או ספונטנית נעשתה ע"י אינקובציה של או 2h או ל- 5h בהתאמה. אנליזה נעשתה ע"י מכשיר ה- BODIPY FL AcLDL (1ng/ml).(BD) FACScan עיכוב של ספיחת LDL/ AcLDL המוגברת ע"י.F nucleatum נעשתה ע"י הוספת החיידק ב- 1 MOI לאינקובציה של שעתיים לאחר השרייה עם המעכבים. לאחר שטיפות, התאים עברו אינקובציה עם 16h או (1ng/ml) BODIPY FL AcLDL ל- אנליזה נעשתה ע"י מכשיר DiI-LDL (.5µg/ml) ה-.(BD) FACScan מודל :Subcutaneous chamber הניסויים הינם בהתאם להוראות הועדה האתית לטיפול בחיות ניסוי, ובוצעו ביחידת ה- SPF של בי"ס לרפואה בהדסה עין כרם. לעכברים בני 6-1 שבועות מסוג הושתלו שני סלילי טיטניום )Chambers )המכונים תת עורית בגב כל חיה תחת הרדמה C57B/6.15% xylazien + 85% ketamin אינטרא-פריטונאלית של 2 l של לאחר תקופת החלמה בת החיידק F. nucleatum ה- שבוע, chamber שימשו כמדור מבודד להשראת תהליך דלקתי. הוזרק.27 gauge 1*1 5 ל- chamber בריכוז של ב- 1μl של PBS ע"י מזרק תוכן ה- chamber נשאב בזמן line= base )בטרם הזרקת הזיהום חיידקי( ולאחר 2h ו- 24h. החלק התאי הופרד מהאקסודט בעזרת סירכוז במהירות נמוכה rpm( 15 למשך 1 דקות ב- )4 c ונלקח לצביעות למרקרים תאיים שונים על מנת לאפיין את אוכלוסיית התאים. החלק הנוזלי אוכסן עד לאנליזה של רמת הציטוקינים ע"י ELISA ב-.-2 c צביעה למרקרים תאיים: החלק התאי שהופרד מהאקסודט עבר ליזיס לכדוריות דם אדומות 5.)eBioscience( באמצעות RBC lysis buffer 2µl שהונחו על כל פלט תאים למשך דקות (ebioscience) anti CD16/CD32 blocking לאחריהן נעשו שטיפות ב- PBS. התאים עברו ע"י -Gr-1(Per-CP),4 c למשך 15 דקות ב- ולאחר מכן נצבעו למרקרים הבאים: מרקר לנויטרופילים ומונוציטים בשלב התמיינות מוקדם. (PE) -CD11b מרקר למונוציטים ולמקרופאגים מתבטא גם על -F4/8 (APC) חלק מהנויטרופילים. (APC) -Ly6-G מרקר לנויטרופילים. מרקר למקרופאגים. כל הנוגדנים נרכשו מחברת USA) -NK1.1 (FITC, ebioscience).biolegend,(san Diego, מרקר לתאי.NK אנליזה נעשתה ע"י מכשיר ה-.(BD) LSR 31

32 ע) IL-1 IL-1, TNF כימות ציטוקינים ע"י :ELISA ריכוז הציטוקינים ו- נמדד בנוזל העליון mouse IL-1β/ IL-1F2 Duo- :ELISA שהופרד מאקסודט ה- chamber ע"י קיטים מסחריים של set ELISA (R&D), mouse TNFα ELISA MAX (Biolegend, San Diego, USA), Opt set כימות הריאקציה נעשה ב-,45nm Optical Density וחישוב הריכוז נעשה.mouse IL-1 (BD) בהתאמה לעקומת ריכוז ידועה של הציטוקינים. כימות יצירת ניטריט - ) 2 :(NO מדידת NO שיוצר ע"י מקרופאגים נעשתה ע"י קביעת ריכוז הניטריט (1% -Griess 1µl במדיום הנאסף מהתאים באמצעות ראקציית.]86[Griess של ראגנט NO 2 - הוספו ל- 1µl sulfanilamide-.1% naphthylene diamine dihydrochloride-2.5% H 3 PO 4 ) של מדיום שנאסף מהתאים בטריפליקטים לפלטת 96. wells כימות הראקציה נעשה באורך גל של 55nm כנגד עקומת כיול של NaNO 2 המורחף במדיום של התאים. כל החומרים נרכשו מסיגמא. :in vivo הסרה (Depletion) של אוכלוסיית המקרופאגים הסרה של אוכ' המקרופאגים נעשתה ע"י הזרקות של ליפוזומים של קלודרונט Amsterdam, (Clodronateliposomes. Org, chambers )n 7 6-1( ע"פ הפרוטוקול הבא: C57BL6 עכברי שבועות עם שני.Netherlands) 4μl "פ מודל subcutaneous chamber אשר תואר לעיל( קיבלו הזרקה של ליפוזומים בהזרקה אינטרא- פריטונאלית בשבעה ובתשעה ימים ממועד ההשתלה. כמו כן הוזרקו לכל אחד מה- עשרה ימים לאחר ההשתלה )ויום אחד לאחר ההזרקה השניה של 5μl chambers של ליפוזומים. PBS 1*1 5 CFU F. nucleatum הליפוזומים( הוזרק החיידק בריכוז של ב- 1μl של לכל 2h הזרקת הזיהום חיידקי(, לאחר )בטרם base בזמן line= נשאב תוכן ה- chamber.chamber rpm( 15 למשך 1 ולאחר 24h. החלק התאי הופרד מהאקסודט בעזרת סירכוז במהירות נמוכה דקות ב- )4 c ונלקח לצביעות למרקרים תאיים שונים על מנת לאפיין את אוכלוסיית התאים ולבחון את הסרת אוכלוסיית המקרופאגים. החלק הנוזלי אוכסן עד לאנליזה של רמת הציטוקין TNFα ע"י ב- 2 c הניסויים הינם בהתאם להוראות הועדה האתית לטיפול בחיות ניסוי, ובוצעו.- ELISA ביחידת SPF של בי"ס לרפואה בהדסה עין כרם. 32

33 4. תוצאות פרק I I.1 מעורבות החיידקים.P gingivalis ו-.F nucleatum ביצירה מוגברת של תאי קצף בעבודה זו נחקרה מעורבותם של הפתוגנים האוראלים.P gingivalis ו-.F nucleatum בתהליכים P. gingivalis המקדמים טרשת עורקים. ישנן עבודות המצביעות על מעורבות בתהליך יצירת תאי קצף ובתהליכים אתרוסקלרוטיים נוספים. עם זאת ההבנה לגבי התהליך המוקדם של הכרות הפתוגן המוביל ליצירת תאי קצף אינה ברורה לגמרי. על כן, בעבודה זו התמקדנו בחקר מנגנוני זיהוי הפתוגנים P. gingivalis ו- nucleatum F. המובילים ליצירת תאי קצף, ובחנו את מעורבותם בתהליכים המקדמים טרשת עורקים. תחילה השוונו את האפקט של הדבקה עם.F nucleatum לזה של.P gingivalis על תהליך יצירת F. nucleatum P. gingivalis (RAW264.7) תאי קצף. שורת תאי מקרופאגים הודגרו עם או בריכוזים עולים ולאחר מכן נחשפו ל- LDL. תאים אשר נחשפו רק ל- LDL שימשו כביקורת. מאחר TLR2 והחיידקים מזוהים ע"י התאים בעיקר דרך TLRs )שהמרכזיים הינם ו- TLR4 (, נבדקה גם יצירת תאי קצף בעקבות חשיפת התאים לליגנדים שונים של TLRs )כפי שפורט בפרק השיטות LDL והחומרים(. תאים שנחשפו ל- בלבד יצרו מעט תאי קצף רמה זו הוגדרה כיצירת תאי קצף ספונטנית. תאים שטופלו ב- gingivalis.p או ב- nucleatum.f הראו יצירה מוגברת של תאי קצף בהשוואה ליצירה הספונטנית של תאי הקצף. MOI-1 )יחס הדבקה של חיידקים כנגד תאים( של.P הראה יצירת תאי קצף רבה יותר לעומת הדבקה ב- 1 MOI עם אותו חיידק. תוצאה זו gingivalis F. מעידה על קשר של תלות בכמות החיידק. תופעה דומה נצפתה בתאים שהודבקו עם.MOI 1 כאשר משווים יצירת תאי קצף ב MOI 5 לעומת כמו כן יצירת תאי קצף רבה,nucleatum יותר נצפתה בתאים שטופלו עם החיידק.F nucleatum ב- 1 MOI בהשוואה לתאים שטופלו בחיידק,)TLR1/2. טיפול עם Pam 3 CSK 4 ב- MOI 1 )ליגנד אשר יוצר אקטיבציה דרך P. gingivalis )אקטיבציה דרך CpG,)TLR4 )אקטיבציה דרך )TLR9 גרמו ליצירה מוגברת של תאי E.coli LPS 33

34 %Foam cells in microscope field TLRs קצף בהשוואה ליצירה הספונטנית של תאי הקצף, בתהליך. דבר המצביע על מעורבות אפשרית של A. 1. Cells 2. Cells +LDL 3. Pg MOI 1 4. Fn MOI B. * * * * * * 5 cells cells +LDL Pg MOI 2 Pg MOI 5 Pg MOI 1 Fn MOI 1 Fn MOI 5 Pam LPS CpG איור מס' 1: יצירת תאי קצף לאחר טיפול בחיידקים.P gingivalis ו- nucleatum.f. מקרופאגים (RAW264.7) הודגרו עם.P gingivalis או.F nucleatum בריכוזים עולים ולאחריה נחשפו ל- LDL. נמדדה רמת יצירת תאי קצף. תאים אשר נחשפו רק ל- LDL שימשו כביקורת. A. תמונות מייצגות של תאי קצף כפי שצולמו במיקרוסקופ אור. 1. תאים ללא טיפול 2. תאים שנחשפו ל- LDL בלבד 3. תאים שנחשפו ל-.P gingivalis ב MOI תאים שנחשפו ל- nucleatum.f ב- 5.MOI תא קצף הוא תא המכיל יותר מ- 1 34

35 טיפות של ליפידים )צבועות אדום(. תוצאות של ניסוי אחד מייצג מתוך שלושה. B. סיכום אחוז יצירת תאי קצף לאחר חשיפה לחיידקים ב- MOI שונים. תוצאות של ניסוי מייצג מתוך שלושה. * - מייצגת מובהקות סטטיסטית של אותו טיפול לעומת קבוצת התאים שנחשפה רק ל- LDL,.5 P.,ANOVA.F nucleatum ו-.P gingivalis טיפול עם בעקבות ו- AcLDL LDL כניסה מוגברת של I.2 בפרק I.1 נעשה שימוש בשיטה מקובלת ונפוצה למדידת יצירת תאי קצף. בפרק זה נעשה שימוש בשיטה חדשה לכימות כניסה של LDL/AcLDL לתאים. שיטה זו בעלת רגישות גבוהה יותר לנוכחות של LDL/ AcLDL בתוך התא, ובכך שיטה זו מאפשרת התמקדות בשלבים מוקדמים יותר של יצירת תאי הקצף וניתן לבחון את השפעת החיידקים על אותם שלבים. השיטה מבוססת על שימוש ב LDL/ AcLDL המסומן פלורוסנטית והקריאות הפלורסנטיות נמדדות ע"י מכשיר ה- FACS. יתרון משמעותי נוסף של שיטה זו הוא רמת הדיוק בקריאה הפלורוסנטית הנמדדת, מהטייה של התוצאות.)BIAS( ובכך מאפשרת הימנעות ניסויי כיול של המערכת נעשו ע"י טטרציית ריכוזים של ה- LDL ו AcLDL המסומנים כל אחד בצבע פלורסנטי שונה. שורת תאי מקרופאגים נחשפו לריכוזים עולים של (1-1ng/ml) או DiI-LDL ניתן לראות כי יש dose dependent manner עם.(1-18ng/ml) ל- AcLDL BODIPY FL עליה בריכוזי ה- AcLDL.LDL/ הריכוז הנבחר של להמשך הניסויים הוא 5ng/ml ושל DiI-LDL ה- AcLDL הוא.1ng/ml ההבדלים בריכוזים בין שני החומרים נובעים מסף הרגישות השונה שלהם ע"י מכשיר ה- FACS. 35

36 9 9 DiI-LDL titration DiI-LDL titration A. B. BODIPY FL Ac-LDL titration BODIPY FL Ac-LDL titration DiI-LDL BODIPY FL-AcLDL cells 1ng/ml cells 1ng/ml cells 1ng/ml cells 1ng/ml ng/ml 5ng/ml ng/ml 5ng/ml ng/ml 5ng/ml ng/ml 5ng/ml 75ng/ml 1ng/ml 1ug/ml 1.8ug/ml 75ng/ml 1ng/ml 1ug/ml 1.8ug/ml איור מס' 1: טטרצית ריכוזי DiI-LDL ו-.BODIPY FL AcLDL שורת תאי מקרופאגים נחשפו לריכוזים עולים של (1-1ng/ml) DiI-LDL או ל- AcLDL.(1-18ng/ml) BODIPY FL רמת בליעת ה- BODIPY FL טטרציית ריכוזי B..DiI-LDL טטרציית ריכוזי A. נמדדה ע"י מכשיר ה- FACS. AcLDL או LDL.AcLDL היסטוגרמה שחורה מלאה מייצגת תאים שלא נחשפו ל- LDL או ל- AcLDL. כל אחת מההיסטוגרמות האחרות מציינת ריכוז שונה של LDL או AcLDL אליו נחשפו התאים. כדי למדוד את ההשפעה של חשיפת החיידקים על LDL/ AcLDL uptake במקרופאגים, בוצעה MOI P. gingivalis MOI 1,5 חשיפה לחיידקים ביחסי הדבקה שונים:.F nucleatum ב- ו- ב- 1,2. לאחר שטיפות, התאים נחשפו ל- LDL/AcLDL המסומנים פלורוסנטית. מן התוצאות עולה כי חשיפת התאים ל- nucleatum.f גרמה להגברה בכניסת ה- LDL לתאים מעבר לכניסה הספונטנית של ה- LDL )איור 3B(. בנוסף, הגברה בכניסת ה- AcLDL לתאים נראתה בעקבות חשיפת התאים ל- זאת בהשוואה לכניסה הספונטנית של ה- AcLDL 3E(. )איור חשיפת התאים ל-.P F. nucleatum.)3a גרמה לעליה בכניסת ה- LDL לעומת הכניסה הספונטנית של ה- LDL )איור מגמה gingivalis.)3d דומה נראתה בתאים שנחשפו ל- gingivalis.p ולאחר מכן ל- AcLDL )איור חשיפת התאים ) E.coli ו- LPS Pam 3 CSK 4 ( לליגנדים של TLRs גרמה להגברה של כניסת ה- AcLDL LDL/ בהשוואה לכניסה הספונטנית.)3C,3F )איור נראה כי בעקבות הטיפול בחיידקים ישנה כניסה רבה יותר של AcLDL לתאים לעומת כניסת ה- LDL לתאים, תופעה זו יכולה לשקף את ההבדלים ברצפטורים השונים המעורבים בזיהוי של modified LDL לעומת,LDL ועל כך נדון בהמשך. 36

37 1 75 A. LDL- uptake RAW cells Cells cells+ldl Pg MOI1+LDL Pg MOI2+LDL B. WT mac.- Fn MOI 1,5 Cells Cells+LDL Fn MOI1+LDL Fn MOI5+LDL C. WT mac.- Pam, LPS Cells Cells+ LDL Pam+ LDL E.Coli LPS +LDL DiI-LDL cells cells+ldl pg D. AcLDL- 1 Pg, HK Pg H.K. pg 1 8 Cells cells+acldl 6 Pg MOI1+AcLDL Pg MOI2+AcLDL DiI-LDL E. RAW - AcLDL uptake Cells cells+acldl Fn MOI1 +AcLDL Fn MOI5+AcLDL DiI-LDL 8 6 F. AcLDL uptake- Pam, LPS Cells Cells+ AcLDL Pam+ AcLDL E.Coli LPS +AcLDL BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL cells AcLDL Pam3csk4 E.coli KPS איור מס' 3: כניסה מוגברת של LDL/ AcLDL בעקבות טיפול עם.P gingivalis ו- nucleatum..f מקרופאגים נחשפו לחיידקים ביחסי הדבקה שונים: (MOI 1,5( F. nucleatum ו- MOI ( P. gingivalis 1,2(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- LDL או ל- AcLDL המסומנים פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה-.FACS התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, ניסוי זה נעשה ארבע פעמים. A-C )פאנל עליון( מדידת כניסה של D-F.LDL )פאנל תחתון( מדידת כניסה של A- D+.AcLDL חשיפה ל- gingivalis.p ב-.Pam 3 CSK 4, E.coli LPS חשיפה ל -C +F.MOI ב- 1,5 F. חשיפה ל- nucleatum -B +E.MOI 1,2 וחלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת LDL בעקבות PRRs מעורבות 3.I חשיפה לחיידקים.P gingivalis ו- nucleatum.f F. nucleatum מאחר ושני החיידקים.P gingivalis ו- גרמו להגברה בכניסת ה- AcLDL,LDL/.F. nucleatum P. gingivalis LDL נבדקה מעורבות TLRs בתהליך כניסת המתווך ע"י או- בניסויים אלו השתמשנו במקרופאגים פריטונאלים שהופקו מעכברי knockout שונים ל- TLRs או בשורות תאי מקרופאגים פריטונאלים שמקורן מעכברי knockout שונים ל- TLRs. 37

38 TLR4 LDL מן התוצאות עולה כי.P gingivalis גורם להגברת כניסת בתאים החסרים ברצפטור באופן הדומה ל- WT )איור,4.1C(. A בתאים החסרים ברצפטור TLR2 לא היתה הגברה בכניסת ה- TLR2/4 מעבר לכניסה הספונטנית 4.1B(. )איור בתאים החסרים את שני הרצפטורים לא LDL היתה הגברה בכניסת ה- LDL מעבר לכניסה הספונטנית )איור 4.1D(. E.coli LPS Pam 3 CSK 4 קבוצות ביקורת כללו שימוש בליגנדים של TLRs )ליגנד ל- TLR2 ( ו- Pam 3 CSK 4 )ליגנד ל- TLR4 ( בכדי לוודא שהתאים מתנהגים באופן שתואם את המוטציה שלהם. 4.1 גרם להגברה בכניסת ה- LDL בתאים החסרים ב- TLR4 באותו אופן כמו בתאי ה- WT )איור פאנל תחתון(. כצפוי, ליגנד זה לא גרם להגברה בכניסת ה- LDL )מעבר לכניסה הספונטנית( בתאים החסרים ב- TLR2 ובתאים ללא.TLR2/4 גרם להגברה בכניסת ה- LDL בתאים החסרים ב- TLR2 ובאופן מפתיע בתאים ללא E.coli LPS TLR2/4 באותו אופן כמו בתאי ה- WT 4.1 )איור פאנל תחתון(. בתאים החסרים ב- לא TLR4 Pam 3 CSK 4 או עם נצפתה הגברה בכניסת ה- LDL מעבר לכניסה הספונטנית בעקבות טיפול עם בו השתמשנו היה מזוהם עם ליגנדים של.TLR2 הקנוי עם זאת עלה החשד שה- LPS.E.coli LPS 38

39 5 6 WT - Pg WT A. - Fn TLR2-/- B. TLR2-/- Pg TLR4-/- C. TLR4-/- Pg TLR2/4-/- D. mac.- TLR2,4-/- Pg MOI1,2 A. WT TLR2-/- B. TLR2-/- Fn TLR4-/- C. TLR4-/- Fn TLR2/4-/- D. mac.- TLR2,4-/- Fn MOI1, Cells Cells Cells+LDL cells+ldl Fn Pg MOI MOI 1+LDL 1+LDL Fn Pg MOI MOI 5+LDL 2+LDL DiI-LDL DiI-LDL WT - Pam,LPS TLR4-/- Pam, LPS TLR2/4-/- mac.- Pam, LPS WT TLR2-/- TLR2-/- Pam, LPS TLR4-/- TLR2,4-/ Cells Cells+ LDL Pam+ LDL E.Coli LPS +LDL LDL TLR2 איור מס' 4.1: מעורבות הרצפטורים מקרופאגים מסוג ו- TLR4 ו בהגברת כניסת ל- נחשפו בעקבות חשיפה ל- MOI ( P. gingivalis DiI-LDL TLR2,4 -/- TLR4 -/-,TLR2 -/-,WT.P. gingivalis 1,2, פאנל עליון( או לליגנדים Pam 3 CSK 4 ו- LPS E.coli )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- LDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה ארבע פעמים. A. כניסת LDL לתאי B..WT כניסת LDL לתאי -/-.TLR2 C. כניסת LDL לתאי TLR2,4 -/- לתאי LDL כניסת.D.TLR4 -/- לעומת זאת, הופתענו לגלות ש.F nucleatum גורם להגברת כניסת LDL בתאים החסרים ברצפטור.WT או חסרים ברצפטור TLR2 באופן הדומה להגברת כניסת ה- LDL בתאי אין כלומר, TLR4 באחד מהרצפטורים הללו בתהליך כניסת ה- LDL.)4.2A,B,C )איור על תלות של.F nucleatum LDL מנת לשלול אפשרות של פיצוי של אחד הרצפטורים על החסר של השני בדקנו כניסת בתאים החסרים את שני הרצפטורים -/-.TLR2,4 מן התוצאות עולה כי.F nucleatum גרם להגברה בכניסת )4.2D TLR2,4 -/- ה- LDL בתאי באופן הדומה ל- WT )איור כך שנראה שאין תהליך של פיצוי על TLR4 חסר באחד הרצפטורים. על כן הסקנו ש-.F nucleatum אינו תלוי ב- TLR2 וב- בתהליך הגברת כניסת ה- LDL. קבוצות הביקורות באיור 4.2 זהות לניסוי הקודם שנעשה ומוצגות באיור

40 ב) 6 WT - Fn A. WT TLR2-/- B. TLR2-/- Fn TLR4-/- C. TLR4-/- Fn TLR2/4-/- D. mac.- TLR2,4-/- Fn MOI1, Cells Cells+LDL Fn MOI 1+LDL Fn MOI 5+LDL LDL TLR2 איור מס' 4.1: מעורבות הרצפטורים ו- TLR4 בהגברת כניסת בעקבות חשיפה ל- MOI DiI-LDL WT - Pam,LPS TLR4-/- Pam, LPS TLR2/4-/- mac.- Pam, LPS WT TLR2-/- TLR2-/- Pam, LPS TLR4-/- TLR2,4-/ F. nucleatum נחשפו ל- TLR2,4 -/- ו TLR4 -/-,TLR2 -/-,WT מקרופאגים מסוג.F. nucleatum מכשיר ה- FACS. התוצאות 75 1,5( לאחר מכן התאים נחשפו ל- LDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מוצגות כהיסטוגרמה של 38 ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה 13 ארבע פעמים. A. כניסת LDL לתאי B..WT כניסת LDL Cells Cells+ LDL Pam+ LDL E.Coli LPS +LDL 13 לתאי -/-.TLR2.C כניסת LDL לתאי -/-.TLR4.D כניסת LDL לתאי -/-.TLR2, DiI-LDL 38 בהמשך בדקנו את מעורבות הרצפטור CD14 בתהליך כניסת ה- LDL. CD14 הוא קו-רצפטור של ה והוא מצוי בצורה מסיסה בסרום או כחלבון GPI המעוגן לממברנת התא. תפקידו הוגדר TLRs בעיקר כחלק מהקומפלקס של TLR4 )קשור להעברת הסיגנל של קומפלקס זה לאחר חשיפה ל-,53[ אבל כיום ידוע שהוא נחוץ לתפקוד אופטימלי של הרצפטורים TLR9, TLR2 ו- TLR7,)LPS 63-65[. מן התוצאות עולה כי.P gingivalis גורם להגברה בכניסת LDL למקרופאגים,WT אך אינו TLRs.)5.1B גורם לאותה ההגברה בתאים החסרים ברצפטור CD14 )איור ליגנדים ספציפיים של לא גרמו להגברה בכניסת ה- LDL בתאים החסרים ב- CD14 כצפוי E.coli ו- LPS Pam 3 CSK 4 P. )איור 5.1 פאנל תחתון(. הממצאים מרמזים על כך שהגברת כניסת ה- LDL לאחר חשיפה ל- תלויה ברצפטור.CD14 gingivalis 41

41 5 38 A. WT CD14-/- B. mac.- CD14-/- Pg MOI 1,2 WT - Pg Cells cells+ldl Pg MOI 1+LDL Pg MOI 2+LDL DiI-LDL WT WT - Pam,LPS CD14-/- CD14-/- mac.- Pam,LPS Cells Cells+ LDL Pam+ LDL E.Coli LPS +LDL DiI-LDL איור מס' 5.1: מעורבות CD14 בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis מקרופאגים E.coli ו- Pam פאנל עליון(,MOI 1,2( P. gingivalis נחשפו ל- CD14 -/- או לליגנדים 3 CSK 4 מסוג WT ו- LPS )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- LDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה-.FACS התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה ארבע פעמים. A. כניסת LDL לתאי.CD14 -/- לתאי LDL כניסת.B.WT TLR2 הוא רצפטור תוך תאי המופעל בתגובה ל- DNA,TLR9 בקטריאלי. ו- TLR4 בעלי -TLR9 תפקיד חשוב בתגובת מערכת החיסון המולדת לזיהום חיידקי ]53, 87[. לאחרונה הראו ש- DNA של.F nucleatum משפעל מקרופאגים דרך.]88[TLR9 בעבודות קודמות שנעשו במעבדתנו הראינו ש- נבלע ע"י מקרופאגים )תוצאות לא מוצגות(, כך שהפעלת רצפטור תוך תאי כגון F. nucleatum.f התוצאות מצביעות על כך ש-.LDL אפשרית בהחלט ויתכן שיש לו תפקיד בהגברת כניסת TLR9 גורם להגברה בכניסת ה- LDL בתאים החסרים ב- TLR9 באופן הדומה לתאי ה- WT nucleatum )איור.)5.2A, C יחד עם זאת עולה כי.F nucleatum אינו גורם להגברה בכניסת ה- LDL בתאים CD14 החסרים ב- CD14 5.2B(. )איור כלומר ישנה תלות של.F nucleatum ברצפטור בתהליך כניסת ה- LDL. תוצאה זו הפתיעה אותנו לאור התוצאות הקודמות המצביעות על כך ש- TLR2 ו- TLR4 אינם מעורבים בכניסת LDL המתווכת ע"י.F. nucleatum אך עם זאת תוצאה זו מצביעה על 41

42 ב) מעורבות אפשרית של TLRs בתהליך כניסת LDL המושרה ע"י החיידק מכיוון ש- CD14 משמש כקו- רצפטור של.TLRs Pam 3 CSK 4 ו- E.coli LPS מגבירים כניסת LDL לתאים החסרים ב- ליגנדים ספציפיים של TLRs CD14 5.2A באופן הדומה לתאי WT )איור 5.2C ו- בפאנל התחתון(. בתאים החסרים ב- TLR9 נראה שאין כל הגברה בכניסת LDL ע"י התאים בעקבות טיפול עם Pam 3 CSK 4 ו- LPS E.coli )איור 5.2B פאנל תחתון( WT A. - Fn WT CD14-/- B. mac.- CD14-/- Fn MOI 1,5 TLR9-/- C. mac.- TLR9-/- Fn MOI 1, Cells Cells+LDL Fn MOI 1+LDL Fn MOI 5+LDL DiI-LDL WT WT - Pam,LPS CD14-/- mac.- Pam,LPS CD14-/- TLR9-/- TLR9-/- mac.- Pam, LPS Cells Cells+ LDL Pam+ LDL E.Coli LPS +LDL DiI-LDL איור מס' 5.1: מעורבות CD14 ו- TLR9 בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum Pam 3 או לליגנדים CSK 4 )MOI 1,5 - מקרופאגים מסוג CD14 -/-,WT ו- -/- TLR9 נחשפו ל- F. nucleatum ו- LPS E.coli )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- LDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה ארבע פעמים. A. כניסת.TLR9 -/- לתאי LDL כניסת.C.CD14 -/- לתאי LDL כניסת.B.WT לתאי LDL 42

43 מעורבות חלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה 1.3.I לחיידקים P. gingivalis ו- nucleatum F. בחסר של MyD88 התגובה האינפלמטורית של מרבית ה- TLRs נפגעת, בעוד שהתגובה של MAL.]61[ TRIF רצפטורים כגון TLR4 ו- TLR3 המעבירים סיגנל דרך נשארת תקינה מתפקד כחלבון מגשר בין MyD88 לבין ה- TIR דומיין של הרצפטור אך רק בהקשר של TLR2 ו ]66, TLR4 TLRs 89 [.על מנת לבדוק את מעורבותם של חלבוני האדפטור של המעורבים בשרשרת העברת הסיגנל בחנו את תהליך כניסת ה- LDL במקרופאגים Knock out ל- -/-,MyD88 TRIF -/- או -/-.MAL גורם להגברה בכניסת ה- LDL במקרופאגים החסרים ב- TRIF באופן הדומה ל- WT P. gingivalis יחד עם זאת,.P gingivalis אינו גורם להגברה בכניסת ה- LDL )מעבר לרמת כניסת )איור 6.1C(. ה- LDL הספונטנית( בתאים החסרים ב- MyD88 ובתאים החסרים ב- MAL )איור,6.1B(. D תוצאות אלו מעידות על תלות של.P gingivalis ב- MyD88 ו- MAL בתהליך כניסת LDL לתאים. ליגנדים ספציפיים של TLRs שימשו אותנו כביקורות - 4 Pam 3 CSK )ליגנד ל- TLR2 ( ו- E.coli LPS )ליגנד ל- TLR4 (. Pam 3 CSK 4 גרם להגברה בכניסת ה- LDL בתאים החסרים ב- TRIF באופן דומה 6.1 לזה של תאי ה- WT )איור פאנל תחתון(. כצפוי, ליגנד זה לא גרם להגברה בכניסת ה- LDL E.coli 6.1 )מעבר לכניסה הספונטנית( בתאים החסרים ב- MAL ו- MyD88 )איור פאנל תחתון(. LPS לא גרם לעליה בכניסת ה- LDL בתאים החסרים ב- MyD88 MAL, ו- TRIF כצפוי )איור 6.1(. 43

44 5 6 A. WT WT - Pg WT - Fn B. Myd88-/- Pg TRIF-/- Pg A. WT B. Myd88-/- Fn TRIF-/- Fn C. MAL-/- mac.- D. Pg MOI 1,2 C. TRIF-/- MAL-/- D. mac.- MAL-/- Fn MOI 1, Cells DiI-LDL DiI-LDL cells+ldl Cells Pg Cells+LDL MOI 1+LDL Pg Fn MOI 2+LDL 1+LDL Fn MOI 5+LDL WT - Pam,LPS WT Myd88-/- Myd88-/- Pam, LPS TRIF-/- TRIF-/- Pam, LPS MAL-/- mac.- MAL-/- Pam,LPS Cells Cells+ LDL Pam+ LDL E.Coli LPS +LDL DiI-LDL איור מס' 6.1: מעורבות חלבוני האדפטור -/- MyD88 MAL -/-, ו- -/- TRIF בהגברת כניסת LDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis מקרופאגים מסוג MAL -/-, MyD88 -/-,WT ו- -/- TRIF נחשפו ל- P. gingivalis )1,2,MOI פאנל עליון( או לליגנדים Pam 3 CSK 4 ו- LPS E.coli )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- LDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג. כל ניסוי נעשה ארבע פעמים. A- כניסת LDL לתאי B-.WT כניסת LDL לתאי -/-.MyD88 C- כניסת.MAL -/- לתאי LDL כניסת -D.TRIF -/- לתאי LDL מעורבות חלבוני האדפטור נבחנו גם בחשיפה של החיידק.F, nucleatum במודל זהה לזה שנבחן בשימוש עם החיידק.P. gingivalis התוצאות מצביעות על כך ש- nucleatum.f גורם להגברה.)6.2C, A WT בכניסת ה- LDL במקרופאגים החסרים ב- TRIF באופן הדומה ל- )איור אין כמו כן, F. nucleatum הגברה בכניסת ה- LDL )מעבר לרמת הכניסה הספונטנית( בעקבות טיפול עם תלות של.F nucleatum בתאים החסרים ב MyD88 ו- MAL )איור,6.2B(. D עובדה זו מעידה על LDL בחלבונים MyD88 ו- MAL בתהליך כניסת לתאים. מכיוון שהתוצאות הקודמות הצביעו על אי 44

45 ב) MAL- MyD88, TLR4 מעורבותם TLR2 של ו- נראה כי הקומפלקס מעורב בשרשרת העברת 6.2 הסיגנל של רצפטור אחר. קבוצות הביקורות באיור זהות לניסוי הקודם שנעשה ומוצגות באיור 6.1 )בפאנל התחתון(. 6 WT - Fn A. WT Myd88-/- Fn TRIF-/- Fn 5 B. Myd88-/- C. TRIF-/- MAL-/- D. mac.- MAL-/- Fn MOI 1, Cells Cells+LDL Fn MOI 1+LDL Fn MOI 5+LDL DiI-LDL WT Myd88-/- Myd88-/- Pam, LPS TRIF MAL -/- TRIF-/- TRIF-/-, MyD88 -/- Pam, LPS ו- בהגברת כניסת LDL בעקבות MAL-/- mac.- MAL-/- Pam,LPS איור מס' 6.1: מעורבות חלבוני האדפטור WT - Pam,LPS 5 חשיפה ל-.F. nucleatum מקרופאגים מסוג MAL -/-, MyD88 -/-,WT ו- -/- TRIF נחשפו ל- F. nucleatum 38 פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. המסומן לאחר מכן התאים נחשפו ל- LDL.)MOI 1, כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג. כל ניסוי נעשה ארבע פעמים. A- כניסת LDL לתאי B-.WT 63 התוצאות מוצגות.MAL 13 -D.TRIF 13 כניסת LDL לתאי -/- כניסת LDL לתאי -/-.MyD88 -C כניסת LDL לתאי -/ Cells Cells+ LDL Pam+ LDL E.Coli LPS +LDL LDL סיכום: P. gingivalis ברצפטורים ו- משפיע על תהליך כניסת ובחלבוני האדפטור במקרופאגים וגורם להגברתו כתלות ו- MAL. F. nucleatum משפיע על DiI-LDL MyD88,CD TLR2 תהליך כניסת LDL במקרופאגים כתלות בקו-רצפטור CD14 ובחלבוני האדפטור MyD88 ו- MAL. מהשוואה שערכנו בין רמות הכניסה הספונטנית של ה- LDL בין כל זני ה- out Knock השונים נראה שאין הבדל משמעותי בכניסה הספונטנית בין כל הזנים השונים איתם עבדנו. 45

46 .F nucleatum המושרה ע"י LDL בתהליך כניסת התפקיד של MyD88 I.4 ישנו חשש שמקרופאגים החסרים ב- -/- MyD88 יכולים להיות עם בעיה מולדת המונעת מהם לקלוט MyD88 בצורה תקינה. ההשערה שלנו הייתה ש חשוב במסלול התגובה לזיהום החיידקי, אך LDL עם זאת אינו חיוני להשפעה על הגברת בליעת ה-.LDL על מנת לבדוק את ההשערה הזו בוצע גירוי MyD88-/- חיידקי על מקרופאגים,WT והאקסודט של התאים הונח על מאקרופאגים ולאחריה בוצעה אינקובציה עם.LDL מודל ניסויי זה מאפשר באופן מלאכותי שפעול של מקרופאגים MyD88- באופן דומה לזה של תאי WT לאחר חשיפה לחיידק, וזאת ללא נוכחות של הגורם המזהם ביחד /- E.coli LPS )RAW WT עם ה-.LDL מקרופאגים )תאי הודגרו עם מספר ריכוזים של והמדיום המכיל ציטוקינים שהופרשו בתגובה אל הטיפול הונח על מקרופאגים פריטונאלים של עכברי LDL.LDL לאינקובציה של 16h ולאחריה התאים נחשפו ל- כניסת לתאים נמדדה ע"י MyD88-/- LDL מכשיר ה- FACS. MyD88-/- תאי שנחשפו למדיום מתאי ה- RAW בלעו במידה רבה יותר MyD88-/- מאשר תאים שנחשפו רק ל- LDL 7A(. )איור כביקורת חשפנו תאי לאותם ריכוזים של.)7B אך לא נצפתה הגברה בכניסת ה- LDL מעבר לכניסה הספונטנית )איור תאי,E.coli LPS )E.coli LPS שנחשפו למדיום RAW )של תאי שטופלו ב- הגבירו את כניסת ה- LDL RAW בהשוואה לכניסה הספונטנית. מגמה דומה נראתה בתאי RAW שטופלו ב- LPS E.coli ישירות )איור התוצאות מרמזות על כך שלמקרופאגים MyD88-/- אין בעיה מולדת המונעת מהם לקלוט.)7C,D חלבון האדפטור MyD88 חשוב במסלול התגובה לזיהום אך אינו חיוני להשפעה על הגברת.LDL בליעת ה-.LDL תאים אלו יכולים להגיב לציטוקינים המופרשים למדיום ותוצאה זו מרמזת על כך שיכולות להיות השפעות אוטוקריניות על תהליך קליטת.LDL 46

47 Myd88-/- peritoneal mac.exposed to RAW sup 7 A. B. Myd88-/- peritoneal mac. treated w ith LPS WT peritoneal C. mac. exposed to RAW sup WT D. peritoneal mac. treated w ith LPS DiI-LDL Cells Cells+LDL Sup (LPS.1µg/ml)+LDL Sup (LPS.1 µg/ml)+ldl DiI-LDL Cells Cells+ LDL LPS.1µg/ml+ LDL LPS.1µg/ml +LDL איור מס' 7: מדידת כניסת LDL לתאי MyD88-/- לאחר טיפול עם מדיום שנאסף מתאי RAW שנחשפו ל- LPS.E.coli אקסודט של מקרופאגים שעברו גירוי חיידקי הונח על מאקרופאגים מסוג WT ו -/- MyD88 לאחריה בוצעה השרייה עם.LDL התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג. ניסוי זה נעשה פעמיים. A- תאי MyD88-/- שטופלו במדיום הנאסף מתאי RAW שנחשפו ל- LPS B-.E.coli תאי MyD88-/- שטופלו ב- RAW תאי D-.)E.coli ל- LPS )שנחשפו RAW שטופלו במדיום הנאסף מתאי RAW תאי C-.E.coli LPS שטופלו ב-.E.coli LPS AcLDL מעורבות PRRs וחלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת בעקבות 5.I חשיפה לחיידקים.P gingivalis ו- nucleatum.f בעקבות הממצאים שתוארו קודם לכן על מעורבותם של החיידקים.P gingivalis ו-.F nucleatum בתהליך כניסת LDL ע"י מקרופאגים. נבדקה מעורבותם בתהליך כניסת AcLDL למקרופאגים. AcLDL הופתענו לגלות כי.P gingivalis גורם להגברה בכניסת בתאים החסרים ברצפטור TLR2 LDL באופן הדומה לתאי ה- WT. תוצאה זו מפתיעה לאור התוצאות הקודמות בהן הראנו שכניסת תלויה ב- TLR2. תוצאה נוספת מפתיעה היא שחיידק זה אינו גורם לעליה בכניסת ה- AcLDL )מעבר 47

48 )8.1C לכניסה הספונטנית( בתאים החסרים ב- TLR4 )איור מכאן עולה כי ישנה תלות ב- TLR4. AcLDL בחסר של שני הרצפטורים TLR2/4 ישנה הגברה בכניסה של לתאים, תוצאה זו הפתיעה אותנו מאחר וישנו חסר של.TLR4 יתכן ש- gingivalis.p מזוהה באופן אחר בתהליך זה )איור.)8.1B,D Pam 3 CSK 4 ו- E.coli LPS שימשו כביקורות. Pam 3 CSK 4 )ליגנד של ליגנדים ספציפיים של TLRs )TLR2 לא הגביר כניסת AcLDL בתאים החסרים ב- TLR2 ובתאים ללא TLR2/4 כפי שציפינו )איור 8.1 פאנל תחתון( כן נצפתה הגברה בכניסת AcLDL בתאים החסרים ב- TLR4. E.coli LPS )ליגנד TLR2/4 AcLDL של )TLR4 לא גרם להגברה בכניסת בתאים החסרים ב- TLR4 ובתאים ללא כפי AcLDL שציפינו 8.1 )איור פאנל תחתון(. לעומת זאת כן היתה הגברה בכניסת בתאים החסרים ב- A. WT B. TLR2-/- D. TLR2,4-/- WT mac (RAW)- Fn MOI 1,5 TLR2-/- mac- Fn MOI 1,5 WT mac.- Pg A. MOI WT1,2 TLR2-/- mac.- B. TLR2-/- Pg MOI1,2 TLR4-/- C. mac.- TLR4-/- Pg Fn MOI1,2 MOI1,5 TLR2/4 D. mac.- TLR2,4-/- Pg Fn MOI1,2 MOI1, TLR Cells BodipyFL-AcLDL Cells+AcLDL BodipyFL-AcLDL Fn cells+acldl MOI 1+AcLDL Fn Pg MOI 5+AcLDL 1+AcLDL Pg MOI 2+AcLDL WT mac (RAW)- WTPam, LPS TLR2-/- mac.- TLR2-/- Pam, LPS TLR4-/- mac- TLR4-/- Pam, LPS TLR2/4 mac.- TLR2,4-/- Pam, LPS Cells Cells+ AcLDL Pam+ AcLDL E.Coli LPS +AcLDL BodipyFL-AcLDL איור מס' 8.1: מעורבות TLR2 ו- TLR4 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis מקרופאגים מסוג TLR4 -/-, TLR2 -/-,WT ו- -/- TLR2,4 נחשפו ל-,MOI 1,2( P. gingivalis פאנל עליון( או לליגנדים Pam 3 CSK 4 ו- LPS E.coli )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- AcLDL המסומן 48

49 ב) פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה יותר מארבע פעמים. A- כניסת AcLDL לתאי B-.WT כניסת AcLDL לתאי -/-.TLR2 C- כניסת.TLR2/4 -/- לתאי AcLDL כניסת -D.TLR4 -/- לתאי AcLDL TLR2 גורם להגברה בכניסת ה- AcLDL בתאים החסרים ברצפטור ו- TLR4 F. nucleatum TLR2/4 -/- AcLDL בהשוואה לתאי ה- WT )איור.)8.2A,B,C כניסת נבדקה בעכברי על מנת לוודא שאין פיצוי של אחד הרצפטורים בחסר של השני. ואכן בתאים החסרים את שני הרצפטורים TLR2/4 ישנה הגברה בכניסת ה- AcLDL בהשוואה לתאי ה- WT )איור.)8.2A,D מכך עולה כי חיידק זה אינו 8.2.AcLDL תלוי ברצפטורים TLR2, TLR4 בתהליך כניסת קבוצות הביקורות באיור זהות לניסוי הקודם שנעשה ומוצגות באיור 8.1 )בפאנל התחתון(. WT mac (RAW)- A. WT Fn MOI 1,5 TLR2-/- mac- B. TLR2-/- Fn MOI 1,5 TLR4-/- C. mac.- TLR4-/- Fn MOI1,5 TLR2/4 D. mac.- TLR2,4-/- Fn MOI1, Cells Cells+AcLDL Fn MOI 1+AcLDL Fn MOI 5+AcLDL BodipyFL-AcLDL WT TLR2-/- mac.- TLR2-/- Pam, LPS TLR4-/- mac- TLR4-/- Pam, LPS TLR2/4 mac.- TLR2,4-/- Pam, LPS איור מס' 8.2: מעורבות TLR2 ו- TLR4 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum WT mac (RAW)- Pam, LPS - 1,5.)MOI לאחר מכן מקרופאגים מסוג TLR4 -/-, TLR2 -/-,WT ו- -/- TLR2,4 נחשפו ל- F. nucleatum התאים נחשפו ל- AcLDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה יותר מארבע פעמים. A- כניסת AcLDL לתאי B-.WT כניסת.TLR2/4 -/ D.TLR4 -/- 4 כניסת AcLDL לתאי AcLDL לתאי -/-.TLR2 -C כניסת AcLDL לתאי Cells BodipyFL-AcLDL P. Cells+ gingivalis מעורבות הקו-רצפטור CD14 נבחנה בתהליכי כניסת.AcLDL מן התוצאות עולה כי AcLDL Pam+ AcLDL E.Coli LPS אינו גורם להגברה בכניסת AcLDL בתאים החסרים ב- CD14 )איור 9.1B(. עובדה זו מצביעה +AcLDL על תלות של חיידק זה בקו-רצפטור CD14 בתהליך כניסת AcLDL לתאים. 49

50 17 A. WT WT mac (RAW)- Pg MOI 1,2 14 CD14-/- mac. - Pg MOI1, Cells BodipyFL-AcLDL cells+acldl Pg MOI 1+AcLDL Pg MOI 2+AcLDL 17 WT WT mac (RAW)- Pam, LPS 14 B. CD14-/- CD14-/- CD14-/- mac. - Pam, LPS Cells BodipyFL-AcLDL Cells+ AcLDL Pam+ AcLDL E.Coli LPS +AcLDL איור מס' 9.1: מעורבות CD14 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.P. gingivalis מקרופאגים E.coli ו- Pam פאנל עליון(,MOI 1,2( P. gingivalis נחשפו ל- CD14 -/- או לליגנדים 3 CSK 4 מסוג WT ו- LPS )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- AcLDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה-.FACS התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה יותר מארבע פעמים. A- כניסת.CD14 -/- לתאי AcLDL כניסת -B.WT לתאי AcLDL לעומת זאת,.F nucleatum גורם להגברה בכניסת AcLDL בתאים החסרים ב- CD14 או ב- TLR9 E.coli ו- LPS Pam 3 CSK 4 באופן הדומה לתאי ה- WT,9.2B(. C )איור הליגנדים גרמו להגברה CD14 בכניסת ה- AcLDL בתאים החסרים ברצפטור או ב- TLR9 באופן הדומה לכניסה בתאי ה-.WT ומכאן עולה כי כניסה מוגברת של AcLDL בעקבות חשיפה ל- nucleatum.f אינה מתווכת ע"י.TLR9 ו- CD14 51

51 ב) Cells Cells+LDL Fn MOI 1+LDL Fn MOI 5+LDL 17 WT WT mac (RAW)- Pam, LPS BodipyFL-AcLDL CD14-/- CD14-/- mac. - Pam, LPS WT mac (RAW)- A. WT Fn MOI 1,5 CD14-/- B. mac. CD14-/- - Fn MOI1,5 TLR9-/- C. mac.- TLR9-/- Fn MOI1, TLR9-/- TLR9-/- mac.- Pam, LPS Cells Cells+ AcLDL Pam+ AcLDL E.Coli LPS +AcLDL איור מס' 9.1: מעורבות CD14 ו- TLR9 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum Pam 3 או לליגנדים CSK 4 )MOI 1,5 - מקרופאגים מסוג CD14 -/-,WT ו- -/- TLR9 נחשפו ל- F. nucleatum ו- LPS E.coli )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- AcLDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה יותר מארבע פעמים. A BodipyFL-AcLDL כניסת AcLDL לתאי -B.WT כניסת AcLDL לתאי -/-.CD14 -C כניסת AcLDL לתאי -/-.TLR9 AcLDL מעורבות חלבוני אדפטור תוך תאיים ספציפיים בהגברת כניסת בעקבות חשיפה 1.5.I לחיידקים P. gingivalis ו- nucleatum F. MAL -/- MyD88 -/- בחנו את כניסת AcLDL למקרופאגים פריטונאלים של עכברי ו- בהשוואה למקרופאגים מעכברי.WT מן הממצאים עולה כי.P gingivalis אינו גורם להגברה בכניסת AcLDL 1.1B, C MyD88 בתאים החסרים את האדפטור MAL או בהשוואה לתאי ה- WT )איור פאנל MAL ו- MyD88 בתהליך כניסת עליון(. תוצאה זו מרמזת על כך שחיידק זה תלוי בשני האדפטורים )TLR2 Pam 3 CSK 4 ה- AcLDL. כביקורת השתמשנו ב- )ליגנד של אשר לא גרם להגברה בכניסת 51

52 E.coli LPS MyD88 MAL ה- AcLDL בתאים החסרים ברצפטורים או ואילו הליגנד כצפוי. גרם להגברה בכניסת ה- AcLDL בתאים החסרים ברצפטורים MAL ו- MyD88 באופן הדומה לכניסת ה- AcLDL בתאי ה- WT )איור 1.1 פאנל תחתון(. B. MAL-/- WT mac (RAW)- A. WT Pg MOI 1,2 MAL-/- mac.- Pg MOI1,2 MyD88-/- C. mac.- MyD88-/- Pg MOI 1, Cells cells+acldl Pg MOI 1+AcLDL Pg MOI 2+AcLDL BodipyFL-AcLDL WT WT mac (RAW)- Pam, LPS 16 MyD88-/- MAL-/- MAL-/- mac.- Pam, LPS 6 MyD88-/- mac.- Pam, LPS Cells Cells+ AcLDL Pam+ AcLDL E.Coli LPS +AcLDL BodipyFL-AcLDL איור מס' 1..1: מעורבות חלבוני האדפטור MAL, MyD88 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל- -/- MAL ו- -/- MyD88 נחשפו ל-,MOI 1,2( P. gingivalis פאנל,WT מקרופאגים מסוג.P. gingivalis עליון( או לליגנדים Pam 3 CSK 4 ו- LPS E.coli )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- AcLDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה יותר מארבע פעמים. A- כניסת AcLDL לתאי B-.WT כניסת AcLDL לתאי -/-.MAL C- כניסת.MyD88 -/- לתאי AcLDL 52

53 ב) MyD88 MAL גורם להגברה בכניסת AcLDL בתאים החסרים את האדפטור או F. nucleatum באופן הדומה לתאי ה- WT )איור,1.2B C פאנל עליון(. מכך עולה שפתוגן זה אינו תלוי ב- MAL או ב- MyD88 בתהליך כניסת ה- AcLDL. זו תוצאה מפתיעה ומעניינת מאחר ונראה כי אין תלות ב-.F. nucleatum המתווך ע"י AcLDL בתהליך כניסת TLRs A. WT MAL-/- mac.- B. MAL-/- Fn MOI1,5 WT mac (RAW)- Fn MOI 1, C. MyD88-/- MyD88-/- mac.- Fn MOI 1, Cells Cells+LDL Fn MOI 1+LDL Fn MOI 5+LDL BodipyFL-AcLDL WT WT mac (RAW)- Pam, LPS 16 MyD88-/- MAL-/- MAL-/- mac.- Pam, LPS 6 MyD88-/- mac.- Pam, LPS Cells Cells+ AcLDL Pam+ AcLDL E.Coli LPS +AcLDL BodipyFL-AcLDL איור מס' 1..1: מעורבות חלבוני האדפטור MAL, MyD88 בהגברת כניסת AcLDL בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum מקופאגים מסוג MAL -/-,WT ו- -/- MyD88 נחשפו ל- )MOI 1,5 - F. nucleatum או לליגנדים Pam 3 CSK 4 ו- LPS E.coli )פאנל תחתון(. לאחר מכן התאים נחשפו ל- AcLDL המסומן פלורוסנטית, קריאה נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה יותר מארבע פעמים. A- כניסת AcLDL לתאי B-.WT כניסת AcLDL לתאי -/-.MAL C- כניסת.MyD88 -/- לתאי AcLDL 53

54 סיכום: בפרק זה הצגנו את מעורבות החיידקים.P gingivalis ו-.F nucleatum בתהליך יצירת תאי קצף ובתהליך כניסת ה- AcLDL LDL/ המוביל ליצירת תאי קצף. בהמשך נבדקה מעורבותם של PRRs בתהליך כניסת ה- LDL המושפע ע"י הפתוגנים. החיידק.P gingivalis גורם להגברה בכניסת ה- LDL דרך הרצפטורים TLR2 ו- CD14 וחלבוני האדפטור MAL ו- MyD88. תוצאה זו לא הפתיעה לאור עבודות קודמות שנעשו במעבדיתנו והראו את מעורבות הקומפלקס TLR2- MyD88 בזיהוי של גורם להגברה בכניסת ה- LDL דרך הרצפטור F. nucleatum לעומת זאת.in vivo P. gingivalis TLR2 וחלבוני האדפטור MAL ו- MyD88. תוצאה זו מפתיעה מכיוון שהרצפטורים ו- TLR4 CD14 הם הרצפטורים העיקריים המעורבים בזיהוי בקטריאלי אך נראה כי אינם מעורבים בתהליך זה. MAL TLR2 בנוסף ידוע ש- CD14 הוא קו-רצפטור של ו- TLR4. מעורבות חלבוני האדפטור ו- MyD88 מעידה על השתתפות רצפטור אחר כנראה ממשפחת ה- TLRs בשרשרת העברת הסיגנל. P. AcLDL מבדיקת מעורבותם של TLRs בתהליך כניסת המושפע ע"י הפתוגנים עולה כי CD14 TLR4 גורם להגברה בכניסת AcLDL דרך הרצפטורים ו- וחלבוני האדפטור gingivalis P. gingivalis ו- MyD88. זו תוצאה מפתיעה המעידה על זיהוי באופן שונה של בתהליך זה. MAL לעומת זאת הופתענו לגלות ש-.F nucleatum גורם להגברה בכניסת ה- AcLDL באופן שאינו תלוי.TLR2/4 ו- TLR4 וגם לא כאשר שניהם חסרים כמו כן ישנה הגברה בכניסת ברצפטורים TLR2.MAL, MyD88 גם בחסר של CD14 וחלבוני האדפטור מכאן עולה כי הגברת כניסת AcLDL.TLRs ככל הנראה מתווכת דרך מנגנון שאינו תלוי ב-.F בעקבות חשיפה ל- nucleatum AcLDL 54

55 פרק II שרשרת העברת הסיגנל המובילה להגברת כניסת ה- LDL/ AcLDL המתווכת ע"י 1.II F. nucleatum F. nucleatum בפרק זה חקרנו את שרשרת העברת הסיגנל המתרחשת לאחר הזיהוי של ע"י LDL/ בתאים. מאחר ונראה שההגברה בכניסת ה- LDL/ ובסופה הגברה בכניסת ה- AcLDL PRRs P. בעקבות טיפול עם.F nucleatum היא הרבה יותר משמעותית בהשוואה לטיפול עם AcLDL.F. nucleatum הוחלט להתמקד בפרק זה בשרשרת העברת הסיגנל המתווכת ע"י gingivalis LDL/AcLDL ההשערה שלנו היתה ש- nucleatum.f מגביר כניסת ע"י שימוש במסלולים הקיימים לכניסת LDL/AcLDL לתאים, או ע"י שימוש במסלול אחר. במסגרת ניסויים אלו השתמשנו במגוון גדול של מעכבים כנגד פקטורים שונים המעורבים בשרשרת העברת הסיגנל בתא. התאים עוברים.1 השרייה עם המעכבים לפני הוספת החיידק או ה- LDL/AcLDL. בחנו שני תהליכים: מעורבות.2 הפקטורים הנבדקים בתהליך כניסת ה- AcLDL LDL/ הספונטנית. מעורבות הפקטורים בתהליך כניסת ה- AcLDL LDL/ לאחר איתגור עם.F. nucleatum LDL NFκB מעורבות הפקטורים PI3K, PKCα,β, p38 ו- בכניסת ספונטנית וכניסה 1.1.II מוגברת בעקבות אינטראקציה עם.F nucleatum טיפול מקדים עם המעכבים ל- PI3K, PKCα,β, p38 ו- IκB-α (מעכב את פקטור השיעתוק )NFκB גרם לכניסה נמוכה באופן משמעותי של LDL לתאים זאת בהשוואה לרמת הכניסה הספונטנית של 11 ה- LDL )תאים שנחשפו רק ל- LDL ללא טיפול מקדים במעכב( )איור פאנל עליון(. מכך נוכל להסיק שפקטורים אלו מעורבים בכניסת ה- LDL הספונטנית לתאים. IκB-α טיפול עם המעכבים ל- p38 ול- גרם לירידה משמעותית בכניסת ה- LDL המוגברת ע"י החיידק. כניסת ה- LDL בעקבות הטיפול עם המעכבים היתה נמוכה יותר מרמת הכניסה הספונטנית LDL של ה- LDL, כלומר כל האפקט של כניסת מעבר לכניסה הספונטנית המתווך ע"י החיידק בוטל PI3K, PKCα,β לא היתה השפעה על כניסת )איור 11 פאנל תחתון(. לטיפול עם המעכבים כנגד 55

56 ה- LDL המוגברת ע"י החיידק. כלומר ניתן להסיק שהם אינם מעורבים בתהליך כניסת ה- LDL המוגבר ע"י.F. nucleatum תוצאה זו מצביעה על כך שבמסלול כניסת ה- LDL המוגבר ע"י החיידק מעורבים p38 ופקטור השיעתוק.NFkB בדיקה שערכנו עם מעכב נוסף ל- p38 (PD169) הניבה את אותן התוצאות, נראתה כניסת LDL נמוכה באופן משמעותי מכניסת ה- LDL הספונטנית )איור 11 לתאים ע"י.F nucleatum פאנל לתחתון(. לסיכום, נראה שהגברת כניסת ה- LDL נעשית דרך חלק מהפקטורים המעורבים בכניסת LDL ספונטנית. LDL יש לציין שלעיכוב של הפקטורים JNK1,2 לא היתה השפעה על תהליך קליטת ספונטנית וקליטת LDL מוגברת בעקבות אינטראקציה עם.F nucleatum )תוצאות לא מוצגות(. 56

57 A. כניסת LDL ספונטנית SB22- P38 p38 inhibitor inhibitor BAY- IκBα IkBa inhibitor Go- PKCα,β inhibitor PI3K inhibitor LY294- PI3K inhibitor A. כניסת LDL ספונטנית SB22- P38 p38 inhibitor inhibitor 9 BAY- IκBα IkBa inhibitor Go- PKCα,β inhibitor LY294- PI3K PI3K inhibitor DiI-LDL DiI-LDL DiI-LDL DiI-LDL Cells Cells+LDL DiI-LDL Inhibitor+LDL DiI-LDL Cells Cells+LDL Inhibitor+LDL DiI-LDL DiI-LDL.F nucleatum בעקבות טיפול עם LDL כניסת B. F. nucleatum Go- עם טיפולPKC inhibitor בעקבות LDL LY294- PI3K כניסת inhibitor.b SB22- P38 p38 inhibitor BAY- IκBα IkBa inhibitor PKCα,β inhibitor PI3K inhibitor P38 BAY- IkBa 75 SB22- p38 inhibitor 75 IκBα inhibitor Go- PKCα,β inhibitor inhibitor LY294- PI3K PI3K inhibitor DiI-LDL 1 cells 1 1 LDL PD169- Fn P38 p38 inhibitor inhibitor DiI-LDL cells LDL PD169- Fn P38 p38 inhibitor inhibitor DiI-LDL DiI-LDL Cells Cells+LDL Fn MOI1+LDL Fn+Inhibitor+LDL Cells Cells+LDL Fn MOI1+LDL Fn+Inhibitor+LDL DiI-LDL DiI-LDL DiI-LDL DiI-LDL DiI-LDL איור מס' 11: השפעת מעכבים כנגד PI3K, PKCα,β, p38 ו- IκB-α על כניסת LDL ספונטנית DiI-LDL וכניסת LDL מוגברת בעקבות חשיפה ל-..F nucleatum מקרופאגים הושרו עם המעכבים למשך שעה לאחריה נעשתה אינקובציה עם LDL למשך 5h. כניסת ה- LDL הספונטנית לאחר הטיפול עם המעכבים נמדדה ע"י.F עליון(. בנוסף מקרופאגים הושרו עם המעכבים למשך שעה. לאחר מכן נעשתה השרייה עם )פאנל FACS LDL השפעת המעכבים על כניסת 16h. ל- LDL לאחריה התאים עברו אינקובציה עם ל- 2h nucleatum בעקבות טיפול עם.F nucleatum נמדדה ע"י מכשיר ה- FACS )פאנל תחתון(. היסטוגרמה שחורה מלאה מייצגת תאים ללא טיפול. היסטוגרמה שחורה דקה מייצגת תאים שנחשפו רק ל- LDL. היסטוגרמה אפורה מייצגת תאים שנחשפו לחיידק ולאחר מכן ל- LDL. היסטוגרמה אפורה מקווקות מייצגת תאים שנחשפו למעכב לאחר מכן לחיידק ובסוף ל- LDL. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה לפחות שלוש פעמים. 57

58 מעורבות הפקטורים PI3K, PKCα,β, p38 ו- NFκB בכניסת AcLDL ספונטנית וכניסה 2.1.II מוגברת בעקבות אינטראקציה עם.F nucleatum AcLDL בהמשך לממצאים הקודמים, בדקנו האם.F nucleatum מגביר כניסת ע"י שימוש במסלול p38 הקיים של כניסת AcLDL לתאים או ע"י שימוש במסלול אחר. טיפול במעכבים כנגד ו- IκB-α גרם לכניסה נמוכה יותר של AcLDL זאת בהשוואה לכניסת ה- AcLDL הספונטנית )איור 12 פאנל תחתון(. יש לציין שלמעכבים כנגד PI3K, PKCα,β לא היתה השפעה על תהליך הכניסה הספונטנית p38 של ה- AcLDL )תוצאות לא מוצגות(. כלומר הפקטורים ו- IκB-α מעורבים בתהליך קליטת AcLDL ספונטנית. AcLDL p38 בנוסף, מן התוצאות עולה כי הטיפול במעכבים כנגד ו- IκB-α גרם לכניסה נמוכה של לתאים זאת בהשוואה לכניסת ה- AcLDL המוגברת ע"י.F. nucleatum כלומר האפקט של כניסה 12 מוגברת של AcLDL )מעבר לכניסה הספונטנית( )איור בוטל פאנל תחתון(. גם כאן למעכבים F. nucleatum המתווך ע"י AcLDL כנגד PI3K ו- PKCα,β לא היתה השפעה על תהליך כניסת )תוצאות לא מוצגות(. טיפול עם מעכב נוסף ל- p38 (PD169) גרם לאותו אפקט של כניסה נמוכה של 12 לתאים לעומת כניסת ה- AcLDL המתווכת ע"י.F nucleatum )איור פאנל תחתון(. AcLDL תוצאה זו מצביעה על כך שבמסלול כניסת AcLDL ספונטנית וכניסת AcLDL המוגברת ע"י החיידק מעורבים p38 ופקטור השיעתוק NFκB ונראה שהחיידק למעשה מגביר את המסלול הקיים. )11 LDL בנוסף נראה כי לעיכוב של p38 יש יותר השפעה על תהליך כניסת לתאים )איור מס' מאשר תהליך כניסת AcLDL לתאים )איור מס' 12(. 58

59 A. כניסת AcLDL ספונטנית 1 SB22- p38 inhibitor SB22- P38 p38 inhibitor A. כניסת AcLDL ספונטנית IκBα inhibitor SB22- P38 inhibitor 75 BAY- IkBa inhibitor BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL Cells AcLDL Inhibitor Cells BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL Cells+AcLDL Cells Inhibitor+AcLDL Cells Inhibitor Cells+AcLDL Inhibitor+AcLDL 11 IκBα inhibitor BAY- IkBa inhibitor.f nucleatum בעקבות טיפול עם AcLDL כניסת B SB22- P38 p38 inhibitor inhibitor 75 1 איור מס' 11: מוגברת בעקבות חשיפה ל-.F. nucleatum מקרופאגים הושרו עם המעכבים למשך שעה לאחריה נעשתה אינקובציה עם AcLDL למשך 2h. כניסת ה- AcLDL הספונטנית לאחר הטיפול עם המעכבים נמדדה ע"י ה-.F עליון(. בנוסף מקרופאגים הושרו עם המעכבים למשך שעה. לאחר מכן נעשתה השרייה עם )פאנל FACS.16h AcLDL ל- 2h לאחריה SB22- P38 inhibitor BAY- IkBa inhibitor.f nucleatum בעקבות טיפול עם AcLDL כניסת B. 1 5 SB22- p38 inhibitor התאים עברו אינקובציה עם ל- השפעת המעכבים על כניסת BAY- IκBα IkBa inhibitor 75 5 IκBα inhibitor PD169- P38 inhibitor BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL Cells BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL Cells+AcLDL Fn MOI1+AcLDL Cells Fn+Inhibitor+AcLDL Cells+AcLDL Fn MOI1+AcLDL השפעת מעכבים כנגד p38 ו- IκB-α על כניסת AcLDL Fn+Inhibitor+AcLDL ספונטנית וכניסת AcLDL nucleatum AcLDL בעקבות טיפול עם.F nucleatum נמדדה ע"י מכשיר ה- FACS )פאנל תחתון(. התוצאות מוצגות PD169- P38 inhibitor PD169- p38 inhibitor PD169- p38 inhibitor כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה לפחות שלוש פעמים..F nucleatum גורם להגברה בביטוי Scavenger receptors על פני שטח התא 2.II כדי לברר מה המנגנון העומד מאחורי ההגברה בכניסת ה- AcLDL LDL/ הצעד הבא שלנו היה לבחון את רמות הביטוי של Scavenger receptors על פני שטח התא לאחר חשיפה ל-.F. nucleatum ל- receptors Scavenger יש תפקיד חשוב ומרכזי בכניסה של modified LDL כגון AcLDL לתאים, 59

60 בעוד ש- LDL minimally modified יכול להכנס דרך ה- SR או דרך הרצפטור ל- LDL ]4, 69[. 67, ה- SR העיקריים האחראיים על בליעת modified LDL הם CD36 ו ]68, SR-A1 71[. 69, גורם להגברה SR-A1 בביטוי הרצפטור ו- CD36 זאת בהשוואה לרמות ה- Base F. nucleatum line של הרצפטור על פני שטח תאים שלא טופלו בחיידק )איור,13A(. C אקטיבציה של התאים ע"י SR-A1 E.coli LPS -TLR4 Pam 3 CSK 4 ליגנדים ל- -TLR2 ו- גרמו להגברה בביטוי הרצפטור בהשוואה לרמות ה- line Base של הרצפטור על פני שטח תאים שלא נחשפו לחיידק )איור 13B(. רק 13D(. על פני שטח התאים )איור גרם להגברה בביטוי הרצפטור CD36 E.coli LPS 1 75 A. SR-A stain Isotype CTRL B. 1 SR-A BL levels Fn MOI 1 75 Fn MOI 5 SR-A ctrl Pam3cys E. Coli LPS SR-A1 levels SR-A1 levels CD36 stain C. D. CTRL CD36 Isotype ctrl SR-A BL levels 5 5 isotype CTRL SR-A BL levels Fn MOI5 Isotype CTRL Fn MOI1 Pam3csk Pam3cys E.coli LPS CD36 BL levels E. Coli LPS 38 Fn MOI 1 38 Fn MOI CD36 levels CD36 levels Isotype CTRL Fn MOI5 CD36 BL levels Fn MOI1 isotype CTRL Pam3csk CD36 BL levels E.coli LPS איור מס' 13: ביטוי Scavenger receptors על פני שטח התאים בעקבות טיפול עם..F nucleatum מקרופאגים נחשפו לחיידקים או לליגנדים של TLRs למשך 16h. לאחר מכן התאים עוברים אינקובציה עם נוגדן כנגד SR-A1 או CD36 למשך 1h. בדיקת ביטוי SR-A1 או CD36 נעשתה ע"י מכשיר ה- FACS. התוצאות מוצגות כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, ניסוי זה בוצע פעמיים. A- צביעה לרצפטור SR-A1 לאחר טיפול עם -B.F. nucleatum צביעה לרצפטור SR-A1 לאחר טיפול בליגנדים Pam 3 CSK 4 ו- LPS.E.coli 61

61 CD36 -D.F. nucleatum צביעה לרצפטור CD36 לאחר טיפול עם צביעה לרצפטור לאחר טיפול -C בליגנדים Pam 3 CSK 4 ו- LPS.E.coli LDL Lipid rafts מעורבות Scavenger receptors ו- בכניסת ספונטנית וכניסה 1.3.II מוגברת המתווכת ע"י.F nucleatum מתווכים כניסה של modified LDL ומתפקדים בתגובות אנטי חיידקיות כ- PRR. כיום ישנן גם SR,6,59[ עדויות רבות על תפקודם כקו-רצפטורים של TLRs ומעורבותם בתיווך תגובות דלקתיות בעקבות הממצאים הקודמים של הגברה בביטוי Scavenger receptors על פני שטח.]74,7 התאים בעקבות אינטראקציה עם.F, nucleatum בחנו את מעורבות (SR) Scavenger receptors בתהליך כניסת.LDL לשם כך, השתמשנו ב- sulfate) DxSO4 (Dextran כמעכב לא ספציפי כנגד ChSO4 (Chondroitin sulfate A, sulfated כביקורת לטיפול עם DxSO4 השתמשנו ב-.SR מן התוצאות עולה כי תאים שטופלו במעכב DxSO4 ולאחר מכן נחשפו.]91,9[ polysaccharide) ל- LDL, בלעו פחות LDL בהשוואה לתאים שלא טופלו במעכב. עם זאת העיכוב היה חלקי בהשוואה CD36 SR-As DxSO4 לכניסת LDL ספונטנית. הסבר לכך הוא העובדה ש- מעכב אך לא את ChSO4.LDL CD36 ומתקבל עיכוב חלקי מכיוון שישנה מעורבות של בתהליך כניסת לטיפול עם 14 לא היה שום אפקט על כניסת ה- LDL הספונטנית )איור פאנל עליון(. תוצאות אלו מרמזות על מעורבות מסויימת של SR בתהליכים אלו. LDL,LDL F. nucleatum תאים שטופלו במעכב DxSO4 ולאחר מכן נחשפו ל בלעו פחות ול- בהשוואה לתאים שטופלו ב- nucleatum.f ואח"כ ב- LDL. כלומר האפקט של ההגברה בכניסת ה- 14 המתווך ע"י.F nucleatum בוטל לחלוטין ע"י המעכב )איור פאנל תחתון(. תוצאה זו LDL מרמזת על כך ש- SR מעורבים מאוד בתהליך כניסת ה- LDL המוגבר ע"י החיידק ועיכוב כנגד ChSO4 רצפטורים אלו מבטל לחלוטין את האפקט המושרה ע"י החיידק. טיפול מקדים עם לא השפיע על כניסת ה- LDL המוגברת ע"י החיידק )איור 14 פאנל תחתון(. SR העברת סיגנל דרך רצפטורים של מערכת החיסון המולדת כגון TLRs או דורשת ארגון של 93[. כדי לקבוע האם הרצפטורים על פני שטח התא במיקרו דומיינים הנקראים,92[Lipid rafts 61

62 האפקט של F. nucleatum מתווך ע"י Lipid rafts השתמשנו ב- cyclodextran) MβCD (methyl-β- מעכב שמפריע ליצירת Lipid rafts ע"י כך שהוא סופח כולסטרול מהממברנה. השפעת טיפול עם מעכב זה נבחנה בתהליכי כניסת LDL ספונטנית וכניסת LDL המתווכת ע"י.F. nucleatum LDL LDL תאים שטופלו במעכב MβCD בלעו באופן משמעותי הרבה פחות בהשוואה לכניסת פאנל עליון(. התוצאות מרמזות על כך שכניסת LDL ספונטנית מושפעת מאוד ספונטנית )איור מרמת הכולסטרול בממברנה ועל כך נדון בהמשך. טיפול מקדים עם MβCD לפני החשיפה לחיידק לא השפיע על כניסת ה- LDL המתווכת ע"י החיידק )איור 14 פאנל תחתון(. נראה כי כניסת LDL DxSO4- SR SR inhibitor inhibitor ChSO4-A - CTRL MCD- lipid Lipid rafts raf inhibitor t inhibitor LDL המוגברת ע"י.F nucleatum אינה מושפעת משינוי ברמת הכולסטרול בממברנה. DxSO4- SR SR inhibitor inhibitor 5 ChSO4-A - CTRL 5MCD- lipid Lipid rafts raf inhibitor t inhibitor 1 1 LDL DxSO4 איור מס' 14: השפעת המעכבים על כניסת ו- MβCD ספונטנית וכניסת מוגברת.F. 1 1 nucleatum 1 מקרופאגים 1 הושרו 3 1 עם המעכבים 3 1 למשך 2 1 שעה לאחריה 1 נעשתה בעקבות חשיפה ל ה- FACS DiI-LDL אינקובציה עם LDL למשך 5h. כניסת DiI-LDL ה- LDL הספונטנית לאחר DiI-LDL הטיפול עם המעכבים נמדדה ע"י F. LDL DiI-LDL 75 )פאנל עליון(. בנוסף מקרופאגים ל- 2h לאחריה הושרו עם המעכבים למשך שעה. התאים עברו אינקובציה עם ל- לאחר מכן נעשתה השרייה עם השפעת המעכבים על כניסת DiI-LDL.16h LDL DiI-LDL 5 DxSO4- SR inhibitor 5 Ch.SO4- CTRL 5 ChSO4- CTRL MCD- lipid Lipid rafts inhibitor raf t inhibitor DiI-LDL DiI-LDL A. כניסת LDL ספונטנית DiI-LDL DxSO4- SR inhibitor ChSO4- Ch.SO4- CTRL CTRL MCD- lipid Lipid rafts inhibitor raf t inhibitor 75 DiI-LDL 1 Cells Cells+LDL Inhibitor+LDL 75 F. nucleatum בעקבות טיפול 75 עם LDL כניסת.B DiI-LDL 1 A. כניסת LDL ספונטנית DiI-LDL Cells Cells+LDL Inhibitor+LDL.F nucleatum בעקבות טיפול עם LDL כניסת B. Cells Cells+LDL Fn MOI1+LDL Fn+Inhibitor+LDL Cells Cells+LDL Fn MOI1+LDL Fn+Inhibitor+LDL nucleatum 62

63 בעקבות טיפול עם.F nucleatum נמדדה ע"י מכשיר ה- FACS כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה לפחות שלוש פעמים. )פאנל תחתון(. התוצאות מוצגות AcLDL Lipid rafts מעורבות Scavenger receptors ו- בכניסת ספונטנית וכניסה 2.3.II מוגברת המתווכת ע"י.F nucleatum תאים שטופלו קודם לכן במעכב DxSO4 ולאחר מכן נחשפו ל- AcLDL, בלעו באופן משמעותי פחות בהשוואה לתאים שנחשפו רק ל- AcLDL פאנל עליון(. )איור 15 רמת ה- AcLDL בתאים AcLDL שטופלו ב- DxSO4 דומה לרמה של תאים ללא טיפול. התוצאה מרמזת על כך שכניסת ה- AcLDL AcLDL ChSO4 הספונטנית מתווכת בעיקר ע"י.SR-A לטיפול עם לא היה אפקט על כניסת הספונטנית. AcLDL ל- nucleatum.f טיפול מקדים עם DxSO4 לפני החשיפה גורם לבליעת נמוכה באופן 15 F. nucleatum ע"י AcLDL משמעותי, וישנו ביטול של אפקט הכניסה המוגברת של )איור פאנל תחתון(. לטיפול עם ChSO4 לא היתה השפעה על כניסת AcLDL מוגברת בעקבות טיפול עם התוצאות מרמזות על כך ש- SR-A מעורבים מאוד בתהליך כניסת AcLDL המתווך.F. nucleatum ע"י.F, nucleatum ועם זאת ככל הנראה ל- CD36 ישנה מעורבות קטנה בתהליך. טיפול במעכב ליצירת השפיע באופן מינימלי על כניסת ה- AcLDL, זאת,)MβCD( Lipid rafts בהשוואה לכניסת ה- הספונטנית )איור פאנל עליון(. התוצאה מרמזת על כך שכניסת 15 AcLDL ספונטנית כמעט ואינה מושפעת משינוי ברמת הכולסטרול בממברנה. טיפול מקדים ב- AcLDL ולאחריו חשיפת התאים ל- nucleatum.f גרם לירידה קלה בכניסת ה- AcLDL בהשוואה MβCD לתאים שנחשפו ל.F nucleatum ול- )איור פאנל תחתון(. התוצאה מרמזת על כך 15 AcLDL שכניסת בעקבות טיפול עם.F nucleatum בדומה לכניסת AcLDL ספונטנית כמעט ואינה AcLDL מושפעת משינוי ברמת הכולסטרול בממברנה. 63

64 1 DxSO4- SR SR inhibitor inhibitor ChSO4-A- ctrl CTRL MCD- Lipid Lipid rafts raf inhibitor t inhibitor 1 1 כניסת AcLDL ספונטנית.A DxSO4- SR SR inhibitor inhibitor ChSO4-A- ctrl CTRL MCD- Lipid Lipid rafts raf inhibitor t inhibitor BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL Cells Cells+AcLDL Inhibitor+AcLDL Cells Cells+AcLDL Inhibitor+AcLDL BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL כניסת BodipyFL-AcLDL.F nucleatum בעקבות טיפול עם AcLDL.B DxSO4- SR SR inhibitor inhibitor ChSO4- Ch.SO4- CTRL CTRL MCD- lipid Lipid raft raf inhibitor t inhibitor 1 75 DxSO4- SR SR inhibitor inhibitor 75 ChSO4- Ch.SO4- CTRL CTRL 75 MCD- lipid Lipid raft raf inhibitor t inhibitor BodipyFL-AcLDL F nucleatum בעקבות טיפול עם AcLDL כניסת B. איור מס' 15: השפעת המעכבים DxSO4 ו- MβCD על כניסת AcLDL ספונטנית וכניסת AcLDL BodipyFL-AcLDL BodipyFL-AcLDL.F. nucleatum מקרופאגים הושרו עם המעכבים למשך שעה לאחריה נעשתה BodipyFL-AcLDL מוגברת בעקבות חשיפה ל- אינקובציה עם AcLDL למשך 2h. כניסת ה- AcLDL הספונטנית לאחר הטיפול עם המעכבים נמדדה ע"י ה-.F עליון(. בנוסף מקרופאגים הושרו עם המעכבים למשך שעה. לאחר מכן נעשתה השרייה עם )פאנל FACS.16h AcLDL ל- 2h לאחריה התאים עברו אינקובציה עם ל- השפעת המעכבים על כניסת BodipyFL-AcLDL nucleatum AcLDL בעקבות טיפול עם.F nucleatum נמדדה ע"י מכשיר ה- FACS )פאנל תחתון(. התוצאות מוצגות 75 5 BodipyFL-AcLDL Cells Cells+AcLDL Fn MOI1+AcLDL Fn+Inhibitor+AcLDL Cells Cells+AcLDL Fn MOI1+AcLDL Fn+Inhibitor+AcLDL כהיסטוגרמה של ניסוי מייצג, כל ניסוי נעשה לפחות שלוש פעמים..F nucleatum על הכרות והתגובה של מקרופאגים ל- השפעת DxSO4 4.II LDL AcLDL DxSO4 בעקבות הממצאים הקודמים אשר מצביעים על האפקט של על כניסת ו- DxSO4 בעקבות טיפול עם.F, nucleatum עלתה ההשערה שיתכן והמעכב מפריע להיכרות החיידק ע"י התאים )ע"י קישור לרצפטור המזהה את.F( nucleatum ומכאן השפעתו על בליעת ה- MOI DxSO4 לשם כך ביצענו את הניסויי הבא: תאי RAW עם הושרו ואותגרו עם.LDL/ AcLDL עולים של.F, nucleatum במקביל לתאי RAW שאותגרו עם החיידק בלבד. כעבור 3h ו- 16h נאסף מדיום מן התאים ונמדדה רמת הציטוקין.TNFα 64

65 TNFα levels pg/ml TNFα levels pg/ml TNFα בתאים שעברו DxSO4 עם השרייה ולאחר מכן איתגור עם החיידק התקבלו רמות שדומות מאוד לרמות המתקבלות בתאים שנחשפו לחיידק ללא השרייה עם המעכב בזמנים 3h וב- 16h )איור F. התוצאות מרמזות על כך שהמעכב DxSO4 אינו חוסם את הרצפטור המזהה את.)16 nucleatum מאחר ויצירת TNFα דומה בתאים שלא טופלו או טופלו קודם לכן במעכב A B. איור מס' 16: השפעת DxSO4 על הכרות והתגובה של מקרופאגים ל-.F nucleatum מדיום נאסף מתאים )3=n( שהודגרו עם.F nucleatum לאחר השרייה עם DxSO4 או ללא השרייה עם המעכב. A. רמות TNFα לאחר שלוש שעות חשיפה לחיידק. B. רמות TNFα לאחר 16 שעות חשיפה לחיידק. תוצאות של ניסוי מייצג מתוך שניים. 65

66 סיכום: מן התוצאות של פרק זה עולה כי בכניסת LDL ספונטנית ישנה מעורבות קלה של SR )מכיוון שחלק מה- LDL הוא )minimally modified LDL וככל הנראה מעורבות רבה של ה- LDLR המתווך PI3K, את מרבית כניסת ה- LDL לתאים. בהמשך שרשרת העברת הסיגנל מעורבים הפקטורים ו-.NFkB PKCα,β, p38 כמו כן נראה שישנה השפעה רבה של תכולת הכולסטרול בממברנה על F. nucleatum LDL כניסת LDL ספונטנית. בתהליך קליטת המתרחש לאחר חשיפה ל ישנה.NFkB p38 מעורבות רבה של,SR ופקטור השיעתוק כמו כן אין השפעה של טיפול עם המעכב F. LDL )פגיעה בתכולת הכולסטרול בממברנה( על כניסת לאחר אינטראקציה עם MβCD F.,LDL נראה כי מבין כמה מסלולים או פקטורים הפועלים בו זמנית בתהליך קליטת.nucleatum.NFkB ופקטור השיעתוק p38,sr דרך מסלול המערב LDL גורם להגברה בכניסת nucleatum במסלול העברת הסיגנל המתרחש בכניסת AcLDL ספונטנית ובכניסת AcLDL לאחר חשיפה ל.F נראה כי קיים מסלול אחד המערב בו p38,sr ואת פקטור השיעתוק.NFkB עם זאת nucleatum MβCD נראה שאין השפעה על כניסת AcLDL בעקבות טיפול עם )הפוגע בתכולת הכולסטרול בממברנה(. CD36 מבדיקת רמת ביטוי SR על פני שטח התא עולה כי ישנה עליה ברמת ביטוי הרצפטורים ו- לאחר חשיפה ל- nucleatum.f. רצפטורים אלו ידועים בהיותם המתווכים העיקריים של SR-A1 כניסת ה- LDL modified ע"י התאים. לאחר מכן בדקנו האם DxSO4 מונע את היכרותו של החיידק.TNFα DxSO4 ע"י התאים, הראנו שהתאים מגיבים לנוכחות.F nucleatum עם וללא ע"י יצירת תוצאה המרמזת על כך ש- DxSO4 אינו נקשר לרצפטור שמזהה את.F nucleatum ואינו מפריע LDL/ להיכרותו ע"י התאים. הממצאים הנ"ל שופכים אור על המנגנונים העומדים מאחורי כניסת AcLDL מוגברת המתווכת ע"י החיידק. 66

67 פרק III.F nucleatum תגובת המאכסן לזיהום תת עורי של 1.III LDL בעקבות הממצאים המוצגים בפרקים הקודמים, בהם נראה ש-.F nucleatum מגביר כניסת TLR2 לתאים באופן שאינו תלוי ברצפטורים TLR2 ו,TLR4 עלתה השאלה האם לרצפטורים ו- TLR4 ישנה חשיבות בהכרות החיידק ע"י המאכסן. כיום, יש מעט ידע לגבי מנגנון ההכרות והתגובה של המאכסן ל-.In vivo.f- nucleatum על כן בפרק זה התמקדנו בהכרות של.F nucleatum ע"י Subcutaneous chamber המאכסן במודלים in vivo ו- vitro.in לשם כך השתמשנו במודל ה- )מודל ה- chamber התת עורי(. זהו מודל מקובל לבחינת אספקטים של דלקת מקומית..F nucleatum בתגובת המאכסן לזיהום של TLR4 ו- מעורבות הרצפטורים TLR2 1.1.III מכיוון ש- TLRs הם הרצפטורים העיקריים של מערכת החיסון המולדת והמזוהים ביותר עם הכרות פתוגנים, נבחן מנגנון ההכרות והתגובה של המאכסן ל- nucleatum.f עם זני עכברים החסרים ב- IL-1 IL-1β נבחנו אלו. שינויים ברמות ביטוי הציטוקינים ו- TNFα )ציטוקינים ו- דלקתיים( TLRs TLR4-/- TLR2-/- )ציטוקין אנטי אינפלמטורי( בתגובה לחיידק. הניסויים בעכברי ו לא בוצעו בו זמנית בגלל קשיים בגידול מושבות העכברים..F nucleatum בתגובת המאכסן לזיהום של מעורבות הרצפטור TLR III נמצאה עליה משמעותית ברמות הציטוקינים שנבדקו שעתיים לאחר הזיהום בהשוואה לרמות לפני TLR2 -/- (WT) הזיהום )רמה בזאלית(. בהשוואה בין עכברים מזן בר לעומת נמצאה עליה משמעותית ביצירת הציטוקינים TNFα, IL-1, IL-1β שעתיים לאחר הזיהום עם.F nucleatum לעומת רמתם לפני הזיהום, ללא הבדל מהותי בין הקבוצות )איור 17(. A,B,C התוצאות תומכות בכך שיצירת TNFα, IL-1, IL-1β בתגובה ל- nucleatum F. אינה תלויה ב- TLR2. באופן מעניין, ישנה עליה ביצירת בתגובה לאיתגור עם.F nucleatum בעכברי לעומת ה- WT שעתיים TLR2 TNFα לאחר הזיהום. תוצאה זו מרמזת על האפשרות שאקטיבציה דרך TLR2 מהווה סיגנל רגולטורי בתגובה לחיידק. 67

68 pg/ml pg/ml pg/ml WT WT WT A. TNFα BL 2h 24h B. IL-1 BL 2h 24h C. IL-1β BL 2h 24h * איור מס' 17: יצירת IL-1 TNFα, ו- IL-1β לאחר זיהום עם.F nucleatum בעכברי -/- TLR2 ו-.WT רמות הציטוקינים (.A) TNFα, (.B) IL-1, (.C) IL-1β נמדדו בחלל ה- chamber במודל ה- subcutaneous chamber בזמנים: 2h,)BL( base line ו- 24h לאחר הזרקה של.F. nucleatum אלו הן תוצאות מייצגות של ניסוי אחד מתוך שלושה. סטיית התקן מתייחסת לחזרות שנעשו בניסוי זה, 7=n בכל קבוצה. * מייצג מובהקות סטטיסטית בהשוואה ל- WT באותה נקודת זמן..5>p TLR2-/- TLR2-/- TLR2-/- 68

69 .F nucleatum בתגובת המאכסן לזיהום של מעורבות הרצפטור TLR III F. TNFα בעכברי -/- TLR4 לא היתה עליה משמעותית ביצירת שעתיים לאחר הזיהום עם IL-1 TLR4 -/- לעומת רמתם לפני הזיהום. בנוסף בעכברי לא היתה עליה ביצירת nucleatum שעתיים לאחר הזיהום עם.F nucleatum לעומת רמתם לפני הזיהום. WT לא נמצאה עליה משמעותית ביצירת IL-1 TNFα, בהשוואה לרמתם בעכברי שעתיים לאחר F. TNFα הזיהום.)18A,B )איור התוצאות תומכות בכך שיצירת ו- IL-1 בתגובה ל TLR4.TLR4 תלויה ב- nucleatumאכן הופתענו לגלות שישנה מעורבות של בתהליך הזיהוי של הפתוגן,in vivo מאחר והתוצאות הקודמות של ספיחת LDL העידו על כך שאין תלות ב- TLR2 וב-.LDL בתהליכי כניסת TLR4 F. לעומת זאת, בעכברי -/- TLR4 ישנה עליה משמעותית ביצירת IL-1β שעתיים לאחר הזיהום עם.)18C לעומת רמתם לפני הזיהום, באופן דומה לזה שנמצא בעכברי- WT )איור nucleatum התוצאות תומכות בכך שיצירת IL-1β בתגובה ל-.F nucleatum אינה תלויה ב- TLR4. העובדה IL-1β שיצירת TNFα תלויה ב- TLR4 ואילו יצירת אינה תלויה ב- TLR4 מעניינת לאור העובדה F. nucleatum ששניהם ציטוקינים דלקתיים. תוצאה זו מרמזת על כך ש- יכול להיות מוכר ע"י המאכסן בכמה דרכים, על כך נתמקד בהמשך. 69

70 pg/ml pg/ml pg/ml 6 A. TNFα * 1 wt BL 2h 24h TLR4-/- 6 B. IL WT BL 2h 24h * TLR4-/ WT C. IL-1β BL 2h 24h TLR4-/- איור מס' 18: יצירת IL-1 TNFα, ו- IL-1β לאחר זיהום עם.F nucleatum בעכברי -/- TLR4 ו- WT רמות הציטוקינים (A.) TNFα, (B.) IL-1, (C.) IL-1β נמדדו בחלל ה- chamber במודל ה- subcutaneous chamber בזמנים: 2h,)BL( base line ו- 24h לאחר הזרקה של.F. nucleatum אלו הן תוצאות מייצגות של ניסוי אחד מתוך שלושה. סטיית התקן מתייחסת לחזרות שנעשו בניסוי זה, 7=n בכל קבוצה. * מייצג מובהקות סטטיסטית בהשוואה ל- WT באותה נקודת זמן..5>p 71

71 כ).F nucleatum איתגור עם לאחר אפיון אוכלוסיות התאים ב- chamber 1.III בכדי לבדוק האם סוגי תאים שונים מגיבים לאיתגור בדרכים שונות )תלוי או לא תלוי ב )TLR4 אפיינו את אוכלוסיות התאים המסתננים לחלל ה- chamber לאחר איתגור עם.F. nucleatum הנוזל מחלל ה- chamber 24 שעתיים ו- שעות לאחר הזיהום סורכז, והמשקע המכיל סוגי תאים שונים נצבע למגוון של מרקרים תאיים ספציפיים למונוציטים, ניוטרופילים ותאי NK ונותח ב- FACS. 24 צביעת אוכ' התאים ב- chamber ל- Gr-1 ול- Ly6-G שעות לאחר איתגור עם 1.2.III F. nucleatum Ly6- כדי לקבל חתך ראשוני של האוכלוסיות המגיבות לאיתגור עם.F nucleatum צבענו למרקרים ול- Gr-1. צביעה זו מאפשרת זיהוי של אוכלוסיית הנויטרופילים )הנצבעים חיובי לשני המרקרים( G 19.)GR-1 והמונוציטים )הנצבעים רק ל ברביע הימני העליון באיור ניתן לראות את הצביעות לנויטרופילים. אוכלוסיה זו מהווה כ- 5% מסך התאים. הנוגדן ל- Gr-1 צובע כנגד שני אפיטופים- Ly6-G ו.Ly6-C נויטרופילים מבטאים את שניהם, ואילו מונוציטים מבטאים רק את Ly6-C ולכן יהיו - שליליים עבור.Ly6-G ברביע השמאלי העליון ניתן לראות את אוכלוסיית המונוציטים אוכלוסיה זו Gr-1.Ly6-G מבטאת Gr-1 ואינה מבטאת את המונוציטים מבטאים רמות שונות של ומהווים כ- מסך התאים 19(. )איור ברביע השמאלי התחתון נמצא אוכלוסיית תאים שאינם מבטאים את 45% מסך התאים( תאים אלו יכולים להיות תאי NK או מונוציטים ומקרופאגים שאינם 4%- GR-1 מבטאים.Gr-1 71

72 FL3-H Gr WT Gr-1,Ly6-G, WT- Gr-1, NK1.1 Ly6-G 45.45% 5.61% %.2% Ly6-G FL4-H איור מס' 19 צביעת Gr-1 ו Ly6-G לתאים שנאספו מה- chamber 14 שעות לאחר איתגור עם.F nucleatum שעות לאחר איתגור עם 24 WT עכבר של תאים נאספו מה- chamber.f. nucleatum ונצבעו ל- Gr-1 ול.Ly6-G אנליזה נעשתה באמצעות ה- FACS. התוצאות מייצגות איחוד של שלושה עכברים. התוצאות חזרו על עצמן בשני ניסויים בלתי תלויים, 6=n. 14 צביעת אוכלוסיית התאים ב- chamber ל- Gr-1 CD11b,,F4/8 ול- NK1.1 שעות 2.2.III F. nucleatum לאחר איתגור עם.F nucleatum בכדי לבחון את תת האוכלוסיות אשר מגיעות ל- chamber בעקבות הזיהום עם השתמשנו במרקרים נוספים. )איור 2(. ניתן לראות באיור 2A ברביע השמאלי העליון אוכלוסיה של תאים שהם -F4/8.CD11b+ זוהי אוכלוסיה מעורבת של נויטרופילים ומונוציטים וניתן לראות שהם בעלי רמות ביטוי שונות של.CD11b אוכלוסיה זו מהווה כ- 87% מכלל אוכלוסיית התאים. ברביע הימני העליון ישנה אוכלוסיה של תאים שהם +F4/8 CD11b+ )מקרופאגים(, וגודלה כ- 1% מכלל Gr-1, CD11b התאים. בנוסף התאים נצבעו למרקרים צביעה זו נעשתה על מנת לאפיין את אוכלוסיית הנויטרופילים והמונוציטים בצורה טובה יותר )איור 2B(. בהתבוננות ברביע הימני העליון ניתן לראות אוכלוסיית תאים שהם CD11b+ Gr-1+, )אוכלוסיה המורכבת מנויטרופילים ומונוציטים(. האוכלוסיה בעלת הביטוי הגבוה יותר של Gr-1 היא הנויטרופילים והאוכלוסיה בעלת הביטוי הנמוך יותר היא המונוציטים. שתי אוכלוסיות אלה מהוות כ- 78% מסך כל התאים. ברביע הימני התחתון - ישנה אוכלוסייה CD11b+ Gr-1- זוהי אוכלוסיית תאים מעורבת המכילה מונוציטים בשלב NK התמיינות מאוחר, מקרופאגים ותאי וקבוצה זו מהווה כ- 19% מכלל האוכלוסיה. מכיוון שאנו 72

73 CD11b PE-A PerCP-A Gr-1 PE-A CD11b PerCP-A Gr-1 יודעים עפ"י הצביעה הקודמת שאוכלוסיית המקרופאגים מהווה כ- 1%, נוכל לומר ש- 9% הנותרים הם מונוציטים ותאי.NK בהמשך בוצעה צביעה נוספת המתמקדת באוכלוסיית תאי ה- NK )צביעה ל- CD11b, NK1.1 )איור 2C((. ברביע הימני העליון נראה אוכלוסיה שהיא NK1.1+.CD11b+ זוהי אוכ' תאי ה- NK והיא מהווה כ- 4.3% מכלל האוכלוסיה. שאר אוכלוסיית התאים מהווה כ- 94% והם בעלי רמות ביטוי שונות של CD11b ואינם מבטאים את.NK1.1 צביעה נוספת נעשתה ל- Gr-1 ו- Gr-1 + ברביע הימני העליון ישנה אוכלוסיית תאי NK המבטאים וברביע הימני.)2D )איור NK1.1 Gr-1.Gr-1 - התחתון ישנה אוכלוסיית תאי NK שהם כלומר חלק מאוכלוסיית תאי ה- NK מבטאים וחלקם לא. עפ"י צביעה זו אוכלוסיית תאי ה- NK מהווה כ- 4.6% מכלל האוכלוסיה. A. WT- CD11b, F4/8 WT- GR-1 CD11b stain % 9.98% B % 78.17% %.2% % 19.12% C APC-A F4/8 WT- CD11b, NK1.1 D PE-A CD11b WT- GR-1, NK % 4.3% % 2.4% %.13% % 2.28% FITC-A NK FITC-A NK1.1 איור מס'.1: צביעה של אוכלוסיות התאים בחלל ה- chamber למרקרים תאיים. תאים נאספו מה- chamber של עכבר 24 WT שעות לאחר איתגור עם.F nucleatum ונצבעו למרקרים הבאים: A. צביעה ל- CD11b ול- F4/8. B. צביעה ל- Gr-1 ול- CD11b. C. צביעה ל- CD11b ול- NK1.1. D. צביעה ל- Gr-1 ול-.NK1.1 תוצאות של ניסוי מייצג. כל איור מייצג תאים מעכבר אחד. 6=n עכברים בקבוצה. 73

74 in vitro.f nucleatum מנגנון ההכרות והתגובה של מקרופאגים ל- 3.III הממצאים הקודמים מצביעים על סתירה בין תהליכי כניסת ליפידים בעקבות החשיפה לחיידק, שהם in vivo אינם תלויים ב- TLR4, לבין יצירת הציטוקינים בעקבות חשיפה לחיידק, שתלויה ב- TLR4.,TNFα סיבה אפשרית לממצאים אלו היא שיתכן שמקרופאגים המצויים ב chamber אינם מייצרים או לחלופין שלמקרופאגים ישנם שני מסלולים המופעלים בתגובה לחיידק - אחד תלוי TLR4 ביצירת הציטוקינים, ואילו השני אינו תלוי ב- TLR4 בתהליכי כניסת ליפידים. בחלק זה של המחקר התמקדנו בתגובת המקרופאגים ל.F nucleatum in vitro מבחינת יצירת ציטוקינים פרו-דלקתיים. יצירת TNFα ע"י מקרופאגים בתגובה ל- nucleatum.f תלויה בחלבון האדפטור 1.3.III TRIF ובחלבון האדפטור TLR4 ו- TLR2 אך לא ב- MyD88 WT, TLR2-/-, תחילה בדקנו את רמת TNFα במדיום שנאסף ממקרופאגים פריטונאלים מעכברי לאחר איתגור עם MOI שונים של.F. nucleatum כביקורות 24h TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/- חיוביות השתמשנו בליגנדים ספציפיים של TLRs על מנת לבדוק שהתאים מתנהגים באופן שתואם.WT בהשוואה לרמת TNFα המיוצרת ע"י תאי תאים החסרים ב- TLR2 וטופלו ב- F. nucleatum לא יצרו TNFα כצפוי, זאת בניגוד לתאים החסרים ב- TLR4 שהראו עליה משמעותית Pam 3 CSK 4 ביצירת TNFα באופן דומה לתאי ה- WT. תאים החסרים ב- TLR4 וטופלו ב- LPS E.coli הראו TLR2 תגובה פחותה משמעותית מה- WT. לעומת זאת, תאים החסרים ב הראו עליה משמעותית ביצירת TNFα באופן דומה לתאי ה- WT )איור 21(. את המוטציה שלהם. השתמשנו ב- Pam 3 CSK 4 )ליגנד ל- TLR2 ( וב- LPS E.coli )ליגנד ל- TLR4 (. ישנה עליה משמעותית ביצירת TNFα במקרופאגים מסוג TLR2-/- או TLR4-/- בעקבות איתגור עם עוד עולה מן התוצאות כי ישנה עליה ביצירת TNFα במקרופאגים TRIF-/- בהשוואה לרמה המיוצרת ע"י מקרופאגים לעומת זאת, מקרופאגים החסרים ברצפטור MyD88 לא הראו עליה ביצירת.WT בהשוואה למקרופאגים )איור התוצאות תומכות בכך שיצירת TNFα בעקבות.)21 WT TNFα 74

75 TNFa pg/ml חשיפה לnucleatum.F תלויה ב- MyD88 אך אינה תלויה ב- TLR2 או ב- TLR4 ובחלבון האדפטור.TRIF * * ** * * * * * * * * WT TLR2-/- TLR4-/- Myd88-/- TRIF-/- Cells Fn MOI 1 Fn MOI 5 Pam LPS איור מס' :11 יצירת TNFα במקרופאגים פריטונאלים מעכברי -/- TRIF WT, TLR2 -/-, TLR4 -/-, MyD88 -/-, לאחר חשיפה ל- nucleatum.f. TNFα רמת ו נמדדה 24h במדיום שנאסף ממקרופאגים פריטונאלים מעכברי לאחר איתגור עם MOI 1,5 של.F. nucleatum קבוצות הביקורת כללו שימוש ב- Pam 3 CSK 4 וב- LPS.E.coli התוצאות מייצגות ניסוי אחד מתוך שלושה. נקודת זמן ואותו טיפול. p<.5 באותה מייצג מובהקות סטטיסטית בהשוואה ל- WT * 3=n. MyD88 ע"י מקרופאגים בתגובה ל- nucleatum.f תלויה בחלבון האדפטור NO יצירת 2.3.III אך לא ב- TLR2 ו- TLR4 ובחלבון האדפטור TRIF NO TNFα על מנת לחזק את התוצאות הקודמות בדקנו יצירת,NO בניגוד ליצירת יצירת היא WT, TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/- TRIF-/- תוצאה של סינרגיה בין סיגנל העובר דרך TLRs לבין סיגנל העובר דרך.]94[IFNγ גם כאן התוצאות מצביעות על כך שיש עליה משמעותית ביצירת NO במקרופאגים TLR2-/- ו TLR4-/- לאחר איתגור באופן הדומה לרמה המיוצרת במקרופאגים.WT מגמה דומה של עליה ביצירת עם F. nucleatum F. nucleatum נראית במקרופאגים TRIF-/- לאחר איתגור עם בהשוואה לרמה המיוצרת NO 75

76 cells Cells+ IFN Fn MOI1 Fn MOI3 Pam LPS cells Cells+ IFN Fn MOI1 Fn MOI3 Pam LPS cells Cells+ IFN Fn MOI1 Fn MOI3 Pam LPS cells Cells+ IFN Fn MOI1 Fn MOI3 Pam LPS cells Cells+ IFN Fn MOI1 Fn MOI3 Pam LPS Nitrite µm MyD88-/- NO.)22 במקרופאגים WT )איור לעומת זאת רמות יצור במקרופאגים נמוכות בצורה,TNFα.WT משמעותית בהשוואה לרמות NO המיוצרות במקרופאגים אך בניגוד להפרשת ישנה.MyD88 עליה קטנה ביצירת NO ל- nucleatum.f בתגובה בהעדר האדפטור התוצאות תומכות MyD88 בכך שיצירת NO בעקבות חשיפה ל- nucleatum.f תלויה ב- אך אינה תלויה ב- TLR2,.TRIF או בחלבון האדפטור TLR * * 2 15 * 1 5 * * # # * # # WT TLR2-/- TLR4-/- MyD88-/- TRIF-/- TRIF -/- ו WT, TLR2 -/-, TLR4 -/-, MyD88 -/- WT, איור מס' 11: יצירת NO במקרופאגים פריטונאלים מעכברי לאחר חשיפה ל- nucleatum.f. רמת NO נמדדה במדיום שנאסף ממקרופאגים פריטונאלים מעכברי 24h לאחר איתגור עם MOI 1,3 של.F. nucleatum קבוצות Pam 3 CSK 4 ו- LPS.E.coli התאים טופלו ב- 2unit של IFNγ הנחוץ לשם TRIF-/- ו TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/- הביקורת כללו שימוש בליגנדים העברת הסיגנל, פרט ל- cells. ריכוז זה של IFNγ לבד אינו גורם ליצירת.NO תוצאות מייצגות של ניסוי אחד מתוך שלושה, 3=n. * מייצג מובהקות סטטיסטית בהשוואה ל- WT באותה נקודת זמן ואותו טיפול, p<.5 *. # - מייצג מובהקות סטטיסטית של.5>p. 76

77 WT הסרת אוכלוסיית המקרופאגים בעכברי 3.3.III NO TNFα הממצאים הקודמים מצביעים על כך שאין תלות ב- TLR2 ו- TLR4 ביצירת ע"י ו- מקרופאגים in vitro בעקבות החשיפה לחיידק )איורים 21 ו- 22 (. כניסת LDL למקרופאגים בעקבות חשיפה לחיידק גם היא אינה תלויה ב- TLR2 ו- TLR4 באופן הדומה ליצירת הציטוקינים. מכאן, נפסלת ההשערה שקיימים שני מסלולים האחד תלוי TLR4 ליצירת ציטוקינים דלקתיים והשני אינו תלוי TLR4 לספיחת.LDL כנראה שהתלות ב- TLR4 שנצפתה in vivo ביצירת TNFα אינה קשורה לנוכחות של מקרופאגים אשר מגיבים לזיהום החיידקי. בכדי לחזק את הטענה שמקרופאגים אינם מעורבים בתגובה האקוטית לאתגור עם החיידק,in vivo נבחנה יצירת ציטוקינים בתגובה להדבקה עם החיידק בעכברים לאחר הורדה של אוכלוסיית המקרופאגים ע"י טיפול בליפוזומים של קלודרונט. WT אפיון אוכלוסיות התאים לאחר הסרה של אוכלוסיית המקרופאגים בעכברי III.in vivo תחילה בוצע אימות של הסרת )Depletion( אוכלוסיית המקרופאגים בוצעו צביעות של אוכלוסיית התאים ב- chamber התת עורי למרקרים תאיים שונים. חתך של אוכלוסיית הנויטרופילים והמונוציטים ב- chamber התקבל ע"י צביעה ל- Gr-1 )איור 23A(. אוכלוסיית הנויטרופילים מבטאת רמות גבוהות של Gr-1 )מסומנת בריבוע כחול( ואילו אוכלוסיית המונוציטים מבטאת רמות נמוכות יותר של מרקר זה )מסומנת בריבוע אדום(. ניתן לראות שבעקבות הטיפול עם הליפוזומים ישנה 23A ירידה משמעותית באוכלוסיית המונוציטים המבטאת את המרקר Gr-1 )איור שמאל( לעומת עכברים שלא עברו טיפול בליפוזומים )איור 23A ימין(. חתך של אוכלוסיית המקרופאגים התקבל ע"י צביעה ל F4/8 )איור 23B(. מן התוצאות עולה כי ישנה ירידה משמעותית באוכלוסיית המקרופאגים המסתננים ל- בעכברים שעברו הסרה של אוכלוסיית המקרופאגים )איור 23B שמאל( chamber בהשוואה לעכברים שלא טופלו בליפוזומים )איור ימין(. 23B התוצאות תומכות בכך שישנה הסרה של אוכלוסיית המקרופאגים והמונוציטים בעקבות טיפול עם ליפוזומים של קלודרונט. 77

78 F4/8 F4/8 FL3-H Gr-1 FL3-H Gr-1 A WT+ Depletion WT depletion- Gr-1 stain.65% 96.9% WT WT - Gr-1 stain 1 4.% 97.7% B % FSC-H WT+ Depletion WT depletion- F4/8 2.1% 1 4.% 2.12% 1 1.% 2.93% FSC-H FSC WT WT - F4/8 1 4.% 7.29% % 97.89% FSC-H FSC 1 1.% 92.71% FSC-H FSC איור מס' 13: צביעה למרקרים תאיים של אוכלוסיות התאים ב chamber בעכברי WT ועכברי WT שעברו depletion למקרופאגים. תאים נאספו 24 שעות לאחר איתגור עם.F nucleatum מה- chamber של עכבר WT ללא טיפול, ועכבר WT שעבר טיפול של הסרת אוכלוסיית המקרופאגים. התאים נצבעו למרקרים הבאים: A. צביעה ל- Gr-1 שער כחול מסמן את אוכ' הנויטרופילים, שער אדום מסמן את אוכ' המונוציטים. B. צביעה ל- F4/8. תוצאות של ניסוי מייצג. כל איור מייצג תאים מעכבר אחד. 6-7=n עכברים בקבוצה. TNFα הסרה של אוכלוסיית מקרופאגים in vivo אינה משפיעה על יצירת לאחר III חשיפה לחיידק.F nucleatum רמת TNFα נמדדה בעכברים שעברו הסרה (depletion) של אוכלוסיית המקרופאגים לעומת קבוצת TNFα הביקורת. התוצאות מצביעות על כך שישנה יצירת בעכברים שעברו הסרה של אוכלוסיית TNFα המקרופאגים בתגובה לאיתגור עם.F. nucleatum בנוסף רמות המיוצרות שעתיים לאחר 78